Prepare una máquina de congelación a alta presión o HPF, al menos dos horas antes de comenzar el experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transfiera portadores de aluminio HPF tipo A a un tubo centrífugo de dos milímetros que contenga un mililitro de etanol y sonicarlos en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos. Seque los portadores en una placa de Petri cubierta con papel de filtro cualitativo.
Remoje los portadores prelimpiados en 1-hexadeceno. Use pinzas finas para recoger un disco de zafiro preparado previamente del plato de cultivo celular HeLa. Toque la superficie etiquetada con papel de filtro cualitativo para eliminar el exceso de medio.
Monte el disco de zafiro en el portamuestras HPF y tape rápidamente el disco con un portador de aluminio de 0,025 milímetros de profundidad que contiene 1-hexadeceno. Aspirar el exceso de solución con papel de filtro cualitativo. Cargue el portamuestras para congelarla a alta presión.
Descargue el conjunto portador de disco de zafiro bajo nitrógeno líquido en una caja criogénica de espuma. Prepare dos mililitros de la solución de fijación de sustitución por congelación o FSF uno en un recipiente redondo de polipropileno de 20 milímetros en una campana extractora y congélelo con nitrógeno líquido. Utilice un par de pinzas preenfriadas para cargar los discos de zafiro y los conjuntos portadores en el recipiente con una solución FSF congelada bajo nitrógeno líquido.
Transfiera este contenedor a una cámara de máquina de sustitución por congelación automatizada preenfriada para el procesamiento FSF a menos 90 grados centígrados. Mantenga las muestras a menos 90 grados centígrados durante una hora, luego separe los discos de zafiro de los portadores con pinzas preenfriadas, asegurándose de que los lados marcados de los discos de zafiro estén hacia abajo. Mantenga las muestras a menos 90 grados centígrados durante 8 a 10 horas adicionales antes de calentarlas hasta menos 60 grados centígrados en tres horas.
Reemplace la solución FSF uno en el recipiente con acetona preenfriada e incubar a menos 60 grados centígrados durante una hora. Repita este lavado de acetona dos veces. Calentar a menos 30 grados centígrados en tres horas.
Mientras tanto, prepare y preenfríe dos mililitros de solución FSF dos en un tubo de centrífuga de dos mililitros a menos 30 grados centígrados. Reemplace la acetona con la solución dos de FSF e incube a menos 30 grados centígrados durante tres horas. A continuación, sustituya la solución dos de FSF en el recipiente con acetona preenfriada e incube durante 30 minutos a menos 30 grados centígrados.
Repita este lavado de acetona dos veces. Calentar por menos 30 a 4 grados centígrados en dos horas. Reemplace la acetona con dos mililitros de tampón HEPES molar 0.2.
Cambie el tampón una vez e incube a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados durante la noche.
