Tome un disco de zafiro tratado con HPF y FSF previamente preparado que contenga células HeLa estables, lávelo con tampón PBS-A durante cinco minutos y repita este proceso tres veces. Transfiera los discos de zafiro a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga un mililitro de tampón PBS-A a temperatura ambiente. Reemplace el tampón PBS-A en la placa de cultivo con un mililitro de solución reductora e incube durante una hora a temperatura ambiente.
Prepare el precursor de oro en un mililitro de solución reductora e inmediatamente mezcle por vórtice. Agregue 80 microlitros de D-penicilamina de 500 milimolares en agua destilada doble a la solución precursora de oro. E inmediatamente vórtice.
Reemplace la solución en el plato cultivado con un mililitro de solución precursora de oro e incube durante dos horas a cuatro grados centígrados. Agregue de 20 a 100 microlitros de la solución de borohidruro de sodio recién preparada a la solución precursora de oro, agite inmediatamente para mezclar bien e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución con dos mililitros de tampón PBS-A para detener la reacción.
Luego prepare la mezcla de resina epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante, transfiera los discos de zafiro a cápsulas de incrustación de fondo plano e infiltre con resina durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Polimerizar la muestra a 60 grados centígrados en un horno durante al menos 18 horas. Prepare secciones ultrafinas de la muestra polimerizada recortando los bloques de la muestra cuidadosamente con una navaja de afeitar para exponer los discos de zafiro.
Sumerja las puntas de los bloques con discos de zafiro en nitrógeno líquido durante varios segundos y descongele la temperatura ambiente. Repita la acción de congelación-descongelación varias veces para separar los discos de los bloques. La proteína EGFP-MTn-KDEL apareció como nanopartículas de oro de dos a cinco nanómetros de tamaño distribuidas exclusivamente en el lumen periférico del RE y en el espacio perinuclear de la envoltura nuclear.
La ultraestructura bien conservada permitió la identificación de moléculas individuales de proteínas marcadas y facilitó el análisis de las interacciones de orgánulos, como las interacciones de las mitocondrias ER. Las nanopartículas de la proteína Ost4-EGFP-MTn delinearon la membrana ER en la membrana externa de la envoltura nuclear. Del mismo modo, las células que expresan Mito-acGFP-MTn exhibieron un etiquetado específico en la matriz mitocondrial.
