Para realizar Southern Blotting, comience cortando una membrana de nylon en un segmento de 10 por 12 centímetros. Haga una muesca en la misma posición que el gel. Active la membrana sumergiéndola en agua destilada, seguida de un tampón de citrato salino de sodio 20X.
Coloque una mecha de papel de filtro en una bandeja invertida doble, colocada de tal manera que los extremos toquen la base de la bandeja exterior. Coloque el gel sobre el papel de filtro. Luego coloque la membrana de nylon activada sobre el gel, asegurándose de que las muescas se superpongan.
Retire cualquier burbuja de aire con una varilla de vidrio. Coloque un montón de dos centímetros de papel de filtro de celulosa de 9,5 por 11,5 centímetros y otro montón de seis centímetros de papel de filtro normal. Coloque un peso encima de la configuración para una distribución equitativa del peso.
Llene la bandeja exterior con tampón de citrato salino de sodio 20X y déjela toda la noche para una transferencia eficiente. Después de la transferencia hacia el sur, fije el ADN transferido en la membrana mediante reticulación UV en un transiluminador UV. Lave la membrana dos veces con 25 mililitros de tampón de citrato salino de sodio 2X.
Para realizar la hibridación, incubar la membrana en 10 mililitros del tampón de hibridación precalentado. Agite suavemente la membrana manualmente a intervalos frecuentes. Luego incubar la mancha en 10 mililitros de tampón de hibridación a 42 grados centígrados durante tres horas con una agitación suave.
Lave la secadora dos veces en 25 mililitros de tampón estricto durante 10 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave. Ahora lave la secadora dos veces en 25 mililitros de tampón estricto precalentado a 50 grados centígrados durante 15 minutos con una agitación suave. Enjuague con 15 mililitros de tampón de lavado durante cinco minutos con una agitación suave a temperatura ambiente.
Incubar la membrana en 10 mililitros de solución bloqueante recién preparada durante 30 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave. Luego colóquelo en 10 mililitros de antidigoxigenina conjugada con una solución de trabajo de fosfatasa alcalina. Lave la secadora dos veces en el tampón de lavado a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Ahora incubar en 10 mililitros de tampón de detección durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el exceso de tampón, coloque la membrana en una hoja de acetato con el lado del ADN hacia arriba. Agregue aproximadamente de uno a 1.5 mililitros de solución de sustrato gota a gota sobre la membrana.
Inmediatamente coloque otra lámina de acetato sobre ella e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Exprima el exceso de solución de sustrato antes de la imagen. Usando un sistema de imágenes de documentación en gel, recopile múltiples imágenes insaturadas en diferentes puntos de tiempo para su análisis.
Después de Southern Blot e hibridación, los fragmentos de restricción de telómeros eran claramente visibles, indicados por un frotis.
