Así que este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la capacidad de los ligandos estrogénicos para regular el receptor de estrógeno alfa y los mecanismos de moduladores selectivos del receptor de estrógeno. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple. Demuestra la actividad de dimerización de dominio alfa ligando dependiente del ligando dependiente del ligando en las células.
Demostrando el procedimiento estará Tanner Jefferson, un estudiante postdoctorado de nuestro grupo. Este método utiliza tres plásmidos diferentes para detectar la actividad de dimerización de dominio de unión de ligando del receptor de estrógeno en las células. pG5-Luc es el plásmido reportero de luciferasa para detectar la eficacia de la actividad de dimerización.
pBIND receptor de estrógeno ratón alfa EF es un factor de transcripción sensible a la gactosa GAL4 ADN a un plásmido de dominio alfa ligando de ratón principal fusionado que se une al elemento sensible GAL4 en el reportero pG5-Luc. pACT ratón receptor de estrógeno alfa EF es un segmento transactivante de virus de herpes simple proteína VP16 dominio de activación fusionado ratón receptor de estrógeno alfa ligando medio plásmido de expresión de dominio que no se une directamente al reportero pG5-Luc. Cuando el ligando adecuado está presente, las proteínas derivadas del receptor de estrógeno del ratón pBIND alfa EF y pACT ratón receptor de estrógeno alfa EF plásmidos se unen a través del dominio de unión de ligando alfa del receptor de estrógeno.
La eficiencia de la dimerización está determinada por la actividad luciferasa. El paso más importante es controlar la actividad de la proteína derivada del receptor de estrógeno del ratón pBIND alpha EF. La actividad del dominio de unión alfa del receptor de estrógeno derivado de pBIND en cada ligando sin el plásmido alfa EF del receptor de estrógeno pACT debe evaluarse antes de analizar la actividad de dimerización de dominio de unión de ligando de estrógeno dependiente del ligando del ligando de ligando dependiente del ligando del ligando.
Comience añadiendo las combinaciones de plásmido apropiadas en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros por combinación. Preparar las dos combinaciones de la mezcla de ADN. El primer tubo contiene el pG5-Luc, el receptor-alfa del pBIND-estrógeno-alfa EF, y los plásmidos pACT vacíos.
El segundo tubo contiene los plásmidos pG5-Luc, pBIND-estrógeno receptor-alfa EF, y pACT-estrógeno receptor-alfa EF. Para precipitar el ADN, añadir un 1/9 del volumen de la mezcla de ADN de tres molares de acetato de sodio y un volumen de acetato de sodio 20X tres molares de 100% etanol a la mezcla de ADN en cada tubo y vórtice de los tubos. Almacene las mezclas a 20 grados centígrados durante la noche antes de centrifugar a máxima velocidad a la mañana siguiente.
Desechar los sobrenadantes y resuspender los pellets invisibles en 120 microlitros de 75% etanol por tubo, teniendo cuidado de enjuagar cualquier ADN pegado a las entrañas de los tubos. Después de una segunda centrifugación en las mismas condiciones, deseche los sobrenadantes y seque el ADN en un concentrador de vacío durante 30 minutos. Para la transfección, lave dos veces las células de carcinoma hepatocelular humano preparadas con 0,5 mililitros de PBS a temperatura ambiente por pozo y alimente las células con 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 grados Celsius fenol y rojo complementado con un 10% de suero bovino fetal termoactivado con 10% de carbón y dos milivolares de L-glutamina.
A continuación, suspenda la mezcla de ADN plásmido seco y el reactivo de transfección en el volumen adecuado de DMEM por número de pozos en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros. Añadir un volumen igual de medio de reactivo de transfección a cada tubo de mezcla de ADN plásmido suspendido por DMEM. Después de una incubación de cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 25 microlitros de mezcla de ADN a los pozos experimentales apropiados de la placa de cultivo de células de carcinoma hepatocelular humano de 24 pocillos para una transfección de seis horas en la incubadora de cultivo celular.
Y al final de la incubación, reemplace el medio de transfecación con 0,5 mililitros de meM fresco libre de fenol fenol de 37 grados Centígrados libres de rojo complementado con 10%DE FBS inactivado por calor, dos milivola de L-glutamina, 1%estreptomicina de penicilina, y ligando por pozo y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante otras 16 a 18 horas. A la mañana siguiente, lave las células con un mililitro de PBS por pozo y conecte las células de cada pozo con 100 microlitros de tampón de lysis pasiva por pozo y agitación vigorosa con un mezclador de vórtice. A continuación, congele los lysates celulares en nitrógeno líquido.
En el día del ensayo de luciferasa doble, agitar los licatos en una coctelera hasta que la placa alcance la temperatura ambiente, y transferir 10 microlitros de liso a pozos individuales de una placa de plástico blanco de 96 pozos. Luego lea la actividad luciferasa de cada muestra de lisosato celular en un lector de microplacas. El tratamiento del receptor de estrógeno de ratón pBIND alfa EF y plásmidos pACT células trans infectadas con 10 estradiol nanomolar estimula la actividad de la luciferasa ya que el dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno contiene el dominio funcional de transactivación dependiente del ligando, AF-2.
Sin embargo, una y 10 concentraciones nanomolares inducen la actividad de la luciferasa en las células transfectadas con la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno alfa PLásmidos EF, lo que sugiere la viabilidad de este procedimiento para evaluar la actividad de dimerización de dominio de unión al ligando alfa del receptor de estrógeno en hasta un nanomolar de tratamiento con estradiol. El tratamiento con 4-hidroxi-tamoxifeno no provoca actividad de luciferasa en el receptor de estrógeno de ratón pBIND alfa EF y pACT plásmido células trans infectadas, lo que sugiere que la función AF-2 del receptor de estrógeno alfa no está activada por este ligando. Hasta 10 concentraciones nanomolares sin embargo, induce la actividad de la luciferasa en las células transfectadas con la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno alfa PLásmidos EF, lo que sugiere que este procedimiento es factible para evaluar la actividad de dimerización de dominio de unión al ligando alfa del receptor de estrógeno en hasta 10 nanomolares de tratamiento de 4-hidroxi-tamoxifeno.
La actividad de la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno ratón alfa ligando dominio de unión plásmidos de expresión de dominio con 4-hidroxi-tamoxifeno es significativamente mayor que la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno humano alfa ligando plásmidos de expresión de dominio. Esto indica que la actividad de homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno del ratón es más potente que el dominio de unión del ligando alfa del receptor de estrógeno humano. Además, la actividad de homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno del ratón que contiene un dominio F humano es significativamente menor que el del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno de ratón salvaje.
Por el contrario, la actividad homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno humano que contiene un dominio F del ratón es significativamente mayor que el del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno humano de tipo salvaje. Esto sugiere que el dominio F tiene una influencia en la actividad de homodimerización de dominio de unión de 4-hidroxi-tamoxifeno dependiente de la especie. Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar la actividad basal del dominio de unión de ADN GAL4 fusionado con el ligando alfa ligando actividad de dominio con su ligando.
Esa actividad debe ser la misma que el tratamiento del vehículo.
