El primer día, después de la reticulación de la cromatina y la recolección de núcleos de 5, 000 gusanos Caenorhabditis Elegans adultos jóvenes, transfiera el pellet de núcleos resuspendido en 450 microlitros de agua limpia a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 mililitros. Luego agregue 60 microlitros de tampón de enzima de restricción 10X DPN2 y mezcle bien. Incubar las muestras con 15 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10% a 37 grados centígrados durante una hora con agitación.
Apague la reacción agregando 75 microlitros de 20% tritón X 100 e incubando como se demostró anteriormente. Alícuota 10 microlitros de la muestra, como control no digerido, y almacénela a cuatro grados centígrados. Después de agregar 400 unidades de DPN 2 al resto de la muestra, incubar durante la noche a 37 grados centígrados con agitación para la digestión de la cromatina.
En el segundo día, agregue 200 unidades adicionales de DPN 2 a la muestra. Para completar la digestión de la muestra reticulada, incubarla a 37 grados centígrados con agitación durante cuatro horas. Inactivar con calor la enzima de restricción incubando la muestra durante 20 minutos a 65 grados centígrados.
Si la enzima no puede ser inactivada por calor, agregue 80 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10% e incube. Luego, agregue 375 microlitros de 20% Triton X 100 a la muestra y mezcle agitando. Mantener a un lado una alícuota de 10 microlitros de la muestra como control de la digestión.
Para la ligadura de la cromatina, transfiera la muestra a un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Ajuste el volumen de la muestra a 5,7 mililitros con agua de grado molecular y mezcle girando. Luego, agregue 700 microlitros de tampón 10 X ligasa T4, seguido de 60 unidades de ligasa de ADN T4, e incube la muestra durante la noche a 16 grados centígrados.
En el tercer día, proceda con la digestión de proteínas y la reticulación inversa. Agregue 30 microlitros de 10 miligramos por mililitro de proteinasa K a la muestra de 3C e incube a 65 grados centígrados durante la noche con agitación. Para comenzar la purificación de la biblioteca 3C en el cuarto día, agregue 30 microlitros de 10 miligramos por mililitro RNasa A a la muestra y mezcle girando.
Después de la incubación, agregue siete mililitros de fenil cloroformo a las muestras y mezcle agitando. Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 3, 270 G y temperatura ambiente. Recoja y transfiera la fase acuosa a un tubo cónico limpio de 50 mililitros.
Añadir volúmenes iguales de cloroformo y mezclar la muestra agitando. Después de centrifugar la muestra nuevamente como se demuestra, transfiera la fase acuosa a otro tubo cónico limpio de 50 mililitros. Agregue 7.5 mililitros de agua de grado molecular, 35 mililitros de 100% de etanol y siete microlitros de un miligramo por mililitro de glucógeno.
Congele la muestra mezclada correctamente a menos 80 grados centígrados. Mientras la muestra se congela, comience a purificar las muestras de control ajustando el volumen de los controles a 500 microlitros utilizando agua de grado molecular. Agregue dos microlitros de 10 miligramos por mililitro de RNasa A y mezcle moviendo el tubo.
A continuación, agregue un mililitro de fenil cloroformo a los tubos que contienen los controles y mezcle agitando. Centrifugar los tubos. Después de transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros, agregue volúmenes iguales de cloroformo.
Centrífuga como se demostró previamente antes de recoger la fase acuosa. A la fase acuosa recolectada, agregue un mililitro de etanol y dos microlitros de un miligramo por mililitro de glucógeno. Después de mezclar la muestra agitando, incubarla a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, centrifugar la muestra durante 15 minutos a 3, 270 G a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, agregue 750 microlitros de etanol refrigerado al 70% y centrifugar. Vuelva a suspender el pellet secado al aire en 50 microlitros de agua de grado molecular.
La suspensión se puede congelar aquí si no se procede de inmediato. Para continuar con la purificación de la muestra 3C, retire la muestra del congelador y centrifugar a 3, 270 G durante 30 minutos. Agregue 10 mililitros de etanol refrigerado al 70% y rompa el pellet de ADN.
Después de centrifugar y retirar el sobrenadante, seque parcialmente la muestra al aire a temperatura ambiente. Re suspender el pellet en 150 microlitros de 10 milimolares tris HCL a pH 7.5 pipeteando hacia arriba y hacia abajo para obtener la biblioteca purificada de 3C. La QPCR realizada en una muestra experimental y dos muestras 3C de control ayudó a generar los datos de eficiencia digestiva.
La muestra de 3C tuvo una eficiencia de digestión de aproximadamente el 88% en los siete loci genómicos probados.
