Este trabajo fue apoyado en parte por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio al Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM103430 y el Centro Bryant de Salud y Ciencias del Comportamiento.

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

<ol>
	<li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation.">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92 (2014).</li><li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns.">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li><li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates.">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li><li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina.">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li><li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells.">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).</li><li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development.">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li><li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription.">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories.">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH.">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li><li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromatin+during+transcription.">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li><li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals.">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li><li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo.">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li><li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging.">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li><li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning:+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern.">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology.">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li><li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus.">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li><li>Crane, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+inputs+into+C.+elegans+dosage+compensation:+Chromosome+conformation+and+the+miRNA-specific+argonaute+ALG-2.">Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2.</a> University of California, Berkeley. , (2012).</li><li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators.">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li><li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells.">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li><li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development.">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li><li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture.">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez-Mi&#241;&#225;n, A., Bessa, J., Tena, J. J., G&#243;mez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture,+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish.">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+&amp;#34;C&amp;#34;+s+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three &amp;#34;C&amp;#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El 3C es una técnica poderosa que tiene sus raíces en técnicas moleculares básicas. Es esta base de herramientas fundamentales lo que hace que 3C sea una técnica tan intrigante para usar con estudiantes universitarios. Con tantos estudios recientes que observan la dinámica de la cromatina a una escala tan amplia, el uso de estos resultados para diseñar un experimento enfocado en un solo gen o región genómica tiene el potencial de crear un experimento único e impactante en la investigación de pregrado. A menudo, experimentos como estos se consideran demasiado avanzados para los estudiantes universitarios, pero con una planificación cuidadosa, son fácilmente alcanzables. Es importante tener en cuenta que los ensayos diseñados para sondear las conexiones de cromatina capturadas por la biblioteca 3C pueden variar desde la PCR semicuantitativa de punto final hasta la secuenciación del genoma completo. De hecho, los datos del primer artículo 3C16 se generaron a partir de qPCR. Esta amplia gama de ensayos se puede utilizar porque todas las tecnologías 3C producen el mismo producto: una biblioteca de fragmentos de ADN que representan conexiones 3D en el núcleo.
Aquí se presenta una adaptación de un protocolo más flexible y complaciente que se ajusta mejor a los investigadores de pregrado. Los períodos de pausa enumerados anteriormente implican retrasos nocturnos; Sin embargo, estas pausas pueden extenderse durante los fines de semana y, en el caso de las células y los núcleos, durante semanas. La consideración más importante es cuándo se realizará el trabajo. A menudo, en los protocolos, hay pasos sensibles al tiempo cuando la pausa no es una opción. Fuera de algunos puntos (día 1 y día 2), hay muchos lugares para detenerse y congelar la muestra. Estos son críticos cuando se trabaja con estudiantes universitarios donde los horarios y horarios del trabajo de laboratorio deben ser flexibles. Además de diseñar estas paradas en el protocolo, se alienta a los estudiantes universitarios a trabajar en parejas o incluso en pequeños grupos de tres o cuatro. Los grupos funcionan bien para este protocolo, ya que los estudiantes pueden apoyarse mutuamente y crear un sistema de compañeros para que todos trabajen de manera segura. El trabajo de laboratorio también es más divertido con otros involucrados. Con los grupos, los estudiantes también pueden trabajar en una variedad de preguntas centradas en la organización de la cromatina mientras realizan el mismo protocolo. Por lo tanto, incluso mientras los estudiantes están trabajando en proyectos separados, el protocolo vincula sus esfuerzos y, debido a esto, pueden apoyarse mutuamente.
Otras adaptaciones están destinadas a evitar el hecho de que ciertas herramientas y equipos especializados no se encuentran necesariamente en todas las instituciones de pregrado. Estos equipos incluyen, entre otros, termocicladores qPCR, sistemas de documentación de gel y espectrómetros de nanovolumen. De hecho, estos equipos son convenientes pero no son un requisito. Aquí, el método clásico de 3C también se describe en la parte de diseño de imprimación; Esto implica identificar un locus genómico de interés y, a partir de eso, evaluar otros loci genómicos para los puntos de contacto de la cromatina más lejanos. Esta técnica también funciona bien si se utiliza un conjunto de datos publicado, como un conjunto de datos que utiliza Hi-C, donde se identifican los loci positivos (conectados) y negativos (no conectados) conocidos. El diseño de experimentos utilizando estos conjuntos de datos publicados es otra gran adaptación para los laboratorios de enseñanza, ya que la posibilidad de identificar con éxito las conexiones de la cromatina suele ser mayor. Además, el artículo de investigación puede ser discutido en clase y ser utilizado como referencia.
Este protocolo utiliza un enfoque de qPCR modificado para visualizar la formación del producto 3C. Los controles son esenciales para el éxito de la técnica 3C. Cada experimento utiliza controles de muestra y controles de cebador para determinar la finalización del procedimiento 3C. Los controles de la muestra incluyen un control no digerido (ADN genómico) y un control digerido. El control no digerido determina la señal de referencia para los juegos de cebadores y se utiliza con el control de digestión reticulado para determinar la eficiencia de digestión Se espera que haya una caída en el producto para cualquier cebador dirigido a través de un sitio de restricción. La comparación de este valor con el control no digerido proporciona una indicación de qué tan bien se digirió la muestra.
Los cebadores para la PCR incluyen un cebador de control y cebadores de prueba. El cebador de control es un conjunto de cebadores que está cerca de la región genómica que se está ensayando y no contiene un sitio de restricción. Esto proporciona la línea de base para determinar la abundancia de los productos de PCR de imprimación de prueba. Los cebadores de prueba son cebadores directos e inversos que flanquean un sitio de restricción para un locus genómico particular de interés (Figura 3). Las reacciones que utilizan estos juegos de imprimación se comparan para determinar la eficiencia de digestión, ya que la abundancia de producto debe disminuir si se ha cortado el sitio de restricción. Al determinar la organización de la cromatina, un cebador de prueba de un locus se empareja con otro cebador de prueba de un locus genómico diferente para determinar si estos dos loci están muy juntos en el espacio 3D. En ese caso, la expectativa es que un producto de PCR solo se encuentre utilizando la muestra 3C como plantilla.
Es importante tener en cuenta que incluso los cebadores validados tienen la tendencia a fallar (Figura 4: juego de cebadores r14). Además, los productos de PCR se identifican con frecuencia en reacciones de control y en reacciones en las que no se predice una conexión de cromatina (como el control digerido, ya que no está ligado). Estas instancias están secuenciadas y fallan en el control de calidad de Sanger o regresan sin una secuencia definida (Figura 5). Además, los experimentos tradicionales de 3C generan una "plantilla de control", una muestra de ADN no entrecruzada, digerida y ligada, que representa todos los posibles fragmentos ligados que se pueden producir con una cantidad dada de ADN. La "plantilla de control" juega un papel importante en la comparación de las intensidades de las señales de qPCR entre dos loci genómicos para determinar si la señal representa una verdadera interacción o simplemente una asociación aleatoria. Crear una "plantilla de control" puede ser problemático, ya que una gran parte de la cromatina que se está ensayando debe capturarse en forma de un cromosoma artificial y procesarse junto con las muestras 3C. Asegurar tal construcción puede no ser factible, y crear uno podría estar fuera del alcance de un proyecto semestral. Debido a estas dificultades, sugerimos usar un cebador de control. El manual de control no reemplaza toda la funcionalidad de la "plantilla de control", pero aún brinda la oportunidad de analizar los datos para hacer determinaciones de "presencia" o "ausencia".
Al realizar qPCR, es importante utilizar cantidades iguales de la muestra. Esto debe determinarse, incluso si se utiliza un nanoespectrofotómetro como una nanogota, generando una curva estándar a partir del ADN genómico de una concentración conocida y ajustando las muestras 3C a esa línea. Estas cantidades deben registrarse y utilizarse en PCR posteriores. La calidad de la reacción de PCR también es importante. Como la PCR se ejecuta en qPCR, la abundancia del producto se mide mediante fluorescencia y se registra. Esta grabación es accesible en la gráfica de amplificación. Una vez finalizado el programa, es importante comprobar la gráfica de amplificación y asegurarse de que las reacciones (excepto los controles sin plantilla) tienen tres fases: una línea base, una exponencial y una fase de meseta/saturación. Es importante comprobar que las reacciones tienen una fase exponencial, en particular para establecer el umbral (véase más adelante). Además, para las muestras diluidas en serie, debe haber un cambio en los valores de Ct consistente con la dilución de la muestra (la concentración más alta tendrá los valores de Ct más bajos, mientras que la concentración más baja tendrá los valores de Ct más altos). Las muestras que no reflejan este cambio en la gráfica de amplificación requieren una nueva dilución o indican un problema mayor con la formación de la muestra 3C. Finalmente, al generar la curva estándar, el software de PCR calculará la eficiencia de PCR y el valor de R2 . La eficiencia de PCR debe ser superior al 90% y el valor deR2 debe ser superior a 0,99. Si no se cumple alguna de estas condiciones, es probable que algo esté mal con la muestra o los cebadores de PCR.
Después de la qPCR, el porcentaje de digestión y la presencia de interacciones 3C se pueden calcular utilizando la qPCR Ct para cada reacción. Para determinarlos, primero, se debe establecer el umbral para la reacción de PCR. Esto se hace normalmente utilizando el software que viene con la máquina qPCR. El establecimiento del umbral definirá la concentración del producto de PCR que se utilizará para comparar los valores de Ct de la muestra. El umbral debe dividir las curvas de amplificación de las reacciones de PCR en la fase exponencial de amplificación. Solo se pueden comparar las reacciones de PCR con amplificación exponencial (en este caso, los cebadores de control y las reacciones del cebador de prueba), ya que esta es la única forma de garantizar que las reacciones amplifiquen el ADN a la misma velocidad y se puedan comparar fielmente. Al analizar los gráficos 3C, las reacciones condicionalmente positivas se identifican como aquellas con más producto sobre las muestras de control, control genómico y control de digestión (Figura 4B). Sin embargo, estas muestras deben validarse aún más mediante la secuenciación de Sanger después de la purificación en gel del producto de PCR.
Después de la secuenciación de Sanger, las muestras que pasan el control de calidad se pueden analizar utilizando Blat. El objetivo de este análisis es determinar si la muestra tiene la secuencia de ambos loci genómicos diana que flanquean el sitio de restricción (DpnII en el caso de este protocolo). Si se identifican ambas secuencias, entonces el fragmento 3C puede considerarse validado. Si los resultados del Blat no devuelven la secuencia esperada, esto puede indicar que uno o ambos cebadores no son óptimos, lo que resulta en un resultado de qPCR falso positivo. Los archivos de seguimiento para las muestras de falsos positivos tendrán picos base indefinidos, y los informes Seq contendrán principalmente "n" llamadas base.
La validación de Sanger es esencial, ya que son posibles los falsos positivos de la formación de productos de PCR artificial. Estos falsos positivos se pueden identificar cuando los productos de secuenciación no tienen la secuencia objetivo esperada o un sitio DpnII característico de un fragmento 3C adecuado (Figura 5). La secuenciación de los fragmentos de PCR también proporciona otro punto de datos para el experimento y lleva a los estudiantes a casa que la técnica 3C está identificando loci genómicos distantes que se están uniendo en el espacio 3D dentro de los núcleos.
La técnica 3C proporciona una gran cantidad de técnicas moleculares fundamentales para estudiantes universitarios en un procedimiento flexible y sencillo. Esta técnica 3C es también un punto de partida para las otras técnicas 3C que incorporan secuenciación de próxima generación (NGS). Este tipo de experimentos pueden exponer a los estudiantes universitarios a aspectos importantes de la bioinformática y se basan en los principios básicos descritos aquí. La experiencia y la participación de pregrado son clave para su éxito y desarrollo como jóvenes científicos. Al proporcionar estas oportunidades, los estudiantes universitarios pueden fortalecer su comprensión de los principios básicos mientras desarrollan su confianza para abordar técnicas y preguntas de vanguardia.

El genoma de un organismo no solo contiene todos los genes necesarios para la función, sino también todas las instrucciones sobre cómo y cuándo usarlos. Esto hace que la regulación del acceso al genoma sea una de las funciones más importantes de la célula. Hay muchos mecanismos para controlar la función de los genes; sin embargo, en su nivel base, la regulación génica se reduce a la capacidad de los factores de transcripción reguladores (transfactores) para unirse a sus secuencias específicas de ADN (secuencias reguladoras cis). Esta no es una habilidad innata; En cambio, se rige por la organización/estructura del genoma en el núcleo, que controla la disponibilidad/exposición de las secuencias cis-reguladoras a los trans-factores 1,2,3. Si los transfactores no pueden encontrar sus secuencias cis-reguladoras, entonces los trans-factores no pueden realizar sus tareas regulatorias. Esto ha hecho que comprender cómo se organizan los genomas en el núcleo sea una fuente importante de investigación.
Es ampliamente aceptado que durante la interfase, los cromosomas eucariotas en el núcleo ocupan su propio dominio anclado a la lámina nuclear y la matriz nuclear (Figura 1), lo que hace que el cromosoma se parezca más a una rebanada de pizza, en lugar de un fideo en un plato de espaguetis. Los cromosomas están parcialmente condensados por interacciones proteína-ADN (cromatina) que retuercen y refuerzan porciones del cromosoma. A través de microscopía electrónica, hibridación tridimensional de fluorescencia de ADN in situ (FISH) y técnicas de marcado de ADN (es decir, metilación de ADN fluorescente y artificial), se ha encontrado que los dominios inactivos de la cromatina están empaquetados firmemente a lo largo de la periferia nuclear 4,5,6, mientras que porciones de cromatina activa y menos condensada se encuentran en el interior del núcleo 7,8,9, 10. Estos experimentos proporcionan una visión de gran angular de la dinámica cromosómica, pero hacen poco para capturar los cambios que ocurren localmente alrededor de los promotores de genes observados en los estudios de DNasa11,12 y nucleosoma13,14,15.
La clave para desbloquear la dinámica de la cromatina de mayor resolución fue la formulación de la técnica de mapeo cromosómico 3D, 3C. La técnica 3C en sí comprende cuatro pasos principales: reticulación de la cromatina, digestión de la cromatina por enzimas de restricción, ligadura de la cromatina y purificación del ADN (Figura 2). Los nuevos fragmentos de ADN artificial generados por este proceso pueden ser caracterizados para revelar la estrecha asociación física entre piezas linealmente distantes de ADN16. La técnica 3C se convirtió en la base para la creación de múltiples técnicas derivadas que utilizan los pasos iniciales de 3C para hacer preguntas más amplias sobre todo el genoma (por ejemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta familia de técnicas 3C ha identificado que los cromosomas están organizados en múltiples unidades discretas denominadas dominios topológicamente asociados (TADs). Los TADs están codificados en el genoma y están definidos por bucles de cromatina flanqueados por límites sin bucle16,17,18,19. Los límites de TAD son mantenidos por dos factores evolutivamente conservados y ubicuos, incluyendo el factor de unión CCCT (CTCF) y la cohesión, que evitan que los bucles dentro de TADs separadosinteractúen 16,20. Los bucles están mediados por la interacción de los transfactores con sus secuencias reguladoras, así como CTCF y cohesión21.
Aunque muchos estudios que utilizan tecnologías 3C hacen preguntas amplias sobre todo el genoma y emplean técnicas complicadas de recolección de muestras, la formulación de la técnica 3C se basa en técnicas básicas de biología molecular. Esto hace que 3C sea intrigante para su implementación tanto en la investigación de pregrado como en los laboratorios de enseñanza. La técnica 3C se puede emplear para preguntas enfocadas más pequeñas y es inherentemente flexible para escalar hacia arriba o hacia abajo (genes individuales22, cromosomas16 y / o genomas18) dependiendo del enfoque y la dirección de las preguntas formuladas. Esta técnica también se ha aplicado a una amplia gama de sistemas modelo 7,16,19,23 y ha demostrado ser versátil en su uso. Esto hace que 3C sea una excelente técnica para estudiantes universitarios, ya que los estudiantes pueden adquirir experiencia en técnicas comunes de biología molecular al tiempo que adquieren una valiosa experiencia en responder preguntas dirigidas.
Aquí se presenta un protocolo adaptado para la preparación de bibliotecas 3C basado en protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo ha sido optimizado para aproximadamente 1 × 107 celdas, aunque ha generado bibliotecas 3C con tan solo 1 × 105 celdas. Este protocolo ha demostrado ser versátil y se ha utilizado para generar bibliotecas 3C a partir de embriones de pez cebra, líneas celulares de pez cebra y Caenorhabditis elegans (lombriz intestinal) adulta joven (YA). El protocolo también debe ser apropiado para líneas celulares de mamíferos y, con mayor adaptación, levadura.
El objetivo de estas adaptaciones es hacer que 3C sea más accesible para los estudiantes universitarios. Se ha tenido cuidado de utilizar técnicas que son similares a las que se pueden lograr en un laboratorio de enseñanza de pregrado. La técnica 3C ofrece muchas oportunidades de aprendizaje para que los estudiantes universitarios aprendan técnicas básicas de biología molecular que beneficiarán su desarrollo en el banco, en el aula y en sus esfuerzos después de la graduación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

La captura de conformación cromosómica (3C) es una herramienta poderosa que ha generado una familia de técnicas similares (por ejemplo, Hi-C, 4C y 5C, denominadas aquí técnicas 3C) que proporcionan información detallada de la organización tridimensional de la cromatina. Las técnicas 3C se han utilizado en una amplia gama de estudios, desde el monitoreo de los cambios en la organización de la cromatina en las células cancerosas hasta la identificación de contactos potenciadores realizados con promotores de genes. Si bien muchos de los estudios que utilizan estas técnicas están haciendo grandes preguntas sobre todo el genoma con tipos de muestras intrincadas (es decir, análisis de células individuales), lo que a menudo se pierde es que las técnicas 3C se basan en métodos básicos de biología molecular que son aplicables a una amplia gama de estudios. Al abordar preguntas estrechamente enfocadas de la organización de la cromatina, esta técnica de vanguardia se puede utilizar para mejorar la investigación de pregrado y la experiencia de laboratorio de enseñanza. Este documento presenta un protocolo 3C y proporciona adaptaciones y puntos de énfasis para la implementación en instituciones principalmente de pregrado en investigación de pregrado y experiencias docentes.

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

Autor destacado: Obtener una A con las 3C: Captura de la conformación cromosómica para estudiantes universitarios  

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

Este procedimiento producirá una muestra experimental de 3C y dos muestras de control (no digeridas y digeridas). Utilizando estas tres muestras, se realizó qPCR. A partir de estos resultados, se calculó la eficiencia digestiva (ecuación 1) y se registró (Tabla 1). A partir de estos cálculos, se determinó que la muestra 3C tenía una eficiencia de digestión de aproximadamente el 88% (promedio de la Tabla 1) en los siete loci genómicos probados.
A continuación, las muestras se analizaron para detectar la presencia de contactos de cromatina de largo alcance entre los diferentes loci genómicos utilizando combinaciones de cebadores específicos de loci (Tabla 2) y qPCR. Usando estos resultados, se calcularon las abundancias de productos en relación con un conjunto de cebadores de control (ecuación 2) y se graficaron para la comparación (Figura 4). Estos datos indicaron que 8 de las 10 reacciones fueron positivas condicionales para interacciones de largo alcance.
Las reacciones de PCR se ejecutaron en un gel de agarosa. El producto de PCR esperado para los ocho positivos condicionales y una reacción negativa se purificaron en gel y se enviaron para la secuenciación de Sanger. Se muestran los resultados de reacciones representativas positivas (flecha azul, cuadro azul) y negativas (flecha roja, cuadro rojo) (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> Figura 1: Estructura cromosómica en el núcleo. Organización cromosómica hipotética dentro del núcleo. A) Envoltura nuclear, líneas negras; B) lámina nuclear, naranja; (C) heterocromatina, líneas compactadas; (D) eucromatina, bucles sueltos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> Figura 2: Esquema del protocolo 3C. Las porciones distantes de cromosomas lineales (azul, amarillo y rosa) se acercan dentro del núcleo a través de bucles reguladores. (A) Las estructuras de bucle están mediadas por factores de transcripción (círculo gris y estrella negra); Estas interacciones se conservan a través de la reticulación química. (B) Los bucles se rompen a través de la digestión enzimática (líneas negras). (C) Las piezas de cromatina distantes se unen entre sí a través de los extremos adherentes creados por la digestión. (D) El ADN se purifica a partir de proteínas. (E) La secuencia dentro de los fragmentos se identifica y se mapea de nuevo al genoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> Figura 3: El esquema de cebador 3C. Los cebadores 3C están diseñados alrededor de sitios de restricción a distancias variables de la ubicación genómica de interés. Las flechas rosadas representan los conjuntos de cebadores experimentales que rodean un sitio DpnII. Los cebadores experimentales se pueden mezclar y combinar para evaluar el bucle de cromatina en la región. Las imprimaciones naranjas representan un control negativo sin un sitio DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> Figura 4: Datos representativos de qPCR para un experimento 3C. Abundancia relativa de los juegos de cebadores de prueba 3C. (A) Gráfico de control que muestra la abundancia relativa del producto en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). b) El experimento 3C; la abundancia relativa del producto a partir de combinaciones de cebadores de prueba en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> Figura 5: Visualización de los productos de qPCR 3C. Top, gel con los productos de punto final de qPCR con las muestras indicadas. Archivos de trazas de secuencia de Sanger representativos e inferiores para las reacciones indicadas. La muestra naranja es un ejemplo de un falso positivo (ver Figura 4, r38/34), y la muestra azul es un ejemplo de un verdadero positivo con el sitio DpnII indicado encima de la traza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sitio</td>
			<td>% digestión</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>r3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Eficiencia digestiva calculada.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td colspan="3">Secuencia</td>
			<td>Loci genómicos</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Cebador de control FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Cebador de control RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Cebadores para el experimento representativo 3C.

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Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Nuestra investigación tiene como objetivo descubrir cómo la organización de la cromatina controla la expresión génica. La atención se centra en determinar qué factores regulan la cromatina a nivel genético para controlar la actividad génica. Actualmente, se utilizan tecnologías similares a la captura de confirmación cromosómica, o 3C, para avanzar en este campo.Las inversiones en tecnologías de recolección y secuenciación de muestras nos han empujado a lo que las técnicas 3C pueden mostrarnos. El mayor desafío experimental actualmente es recolectar muestras con una arquitectura de cromatina uniforme. La heterogeneidad en las muestras conduce a resultados confusos.En el futuro, nos centraremos en cómo los cambios en la organización de la cromatina juegan un papel en el cáncer.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K vistas.  Bryant University. Nuestra investigación tiene como objetivo descubrir cómo la organización de la cromatina controla la expresión génica. La atención se centra en determinar qué factores regulan la cromatina a nivel genético para controlar la actividad génica. Actualmente, se utilizan tecnologías similares a la captura de confirmación cromosómica, o 3C, para avanzar en este campo.Las inversiones en tecnologías de recolección y secuenciación de muestras nos han empujado a lo que las técnic...

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Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Investigación

Genética

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

Biblioteca de generación y purificación de captura de conformación cromosómica (3C)

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.