Para infectar cotiledones de soja con Agrobacterium rhizogenes, diseñe cebadores para detectar el gen del plásmido TI virD2 utilizando la secuencia del plásmido Agrobacterium rhizogenes PRI2659 plásmido. Después de la transformación, pruebe las colonias de Agrobacterium para la retención de virD2 por PCR utilizando un kit de PCR. Después de seleccionar las colonias de Agrobacterium rhizogenes que contienen tanto virD2 como el gen de interés, raye algunas colonias en las placas LB que contienen 100 miligramos por litro de espectinomicina para el plásmido de interés.
Al día siguiente, con una punta de pipeta P200, raspe una longitud de 1,5 centímetros del Agrobacterium de la placa LB y vuelva a suspenderla en un mililitro de tampón fosfato. Diluir la suspensión celular resuspendida y esterilizar agua ultrapura en acetotiringona. Mida la absorbancia utilizando un tubo de cubeta a una densidad óptica de 600 nanómetros.
Luego, en un gabinete de bioseguridad, sumerja un bisturí esterilizado en la solución de Agrobacterium y haga un corte de un milímetro de profundidad a lo largo de la superficie interna del cotiledón. Coloque de seis a ocho cotiledones cortados con el lado hacia abajo en una placa de Petri que contenga papel de filtro saturado con germinación y medio de cultivo con acetosiringona. Incubar las placas a temperatura ambiente durante tres días bajo un período fotográfico de 16 horas.
Después de tres días, transfiera los cotiledones infectados al crecimiento de la raíz peluda o placas de HRG. Incubar las placas en las cámaras de crecimiento fijadas a 22 grados centígrados y una intensidad de luz de 100 micromoles en un período fotográfico de 16 horas hasta que se observen raíces primarias con raíces secundarias de dos a tres centímetros de longitud. Después de tres o cuatro semanas, cosecha las raíces primarias que crecen desde el callo y contienen raíces secundarias usando un bisturí estéril y fórceps.
Transfiera las raíces a placas HRG de selección que contengan antibióticos apropiados y déjelas crecer durante cinco días adicionales. En el quinto día, cosecha raíces peludas transgénicas con raíces secundarias de tres a seis centímetros de longitud. Si observa proteínas fluorescentes, asegúrese de que las raíces secundarias tengan poca autofluorescencia.
Luego, para realizar tratamientos elicitores o químicos, corte las raíces secundarias en trozos de un centímetro y coloque aproximadamente 100 miligramos en agar HRG en una pila. Luego sature la pila con 80 microlitros de la solución de tratamiento adecuada y deje que la placa se incube a temperatura ambiente. Después de 24 horas, para la extracción de ARN, seque rápidamente las raíces en una toalla de papel esterilizada y cólelas directamente en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Selle inmediatamente la parte superior del tubo con parafilm y haga dos agujeros pequeños con pinzas puntiagudas. Se muestran los resultados de PCR de colonias de la Agrobacteria transformada. Las colonias positivas en PCR indicaron el gen de interés.
Sin embargo, entre un tercio y la mitad de las colonias fueron negativas para el cribado del gen virD2. La microscopía de fluorescencia demuestra la localización subcelular de GFP-GmJAZ1-6. El análisis de expresión génica confirmó la sobreexpresión del factor de transcripción de gliceolina GmHSF6-1 y el silenciamiento de ARNi de GmMYB2912 en las raíces de Williams 82 harry.
