Para empezar, toma el cerebro aislado de las crías de ratón sacrificadas y colócalo en una placa de Petri de tres centímetros que contenga MEM frío con EBSS y PSN 2X. Bajo un endoscopio de disección, separe los hemisferios cerebrales, extraiga y deseche el mesencéfalo, el hipocampo y las meninges. Coloque ambos hemisferios corticales en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de MEM EBSS con 2X PSN, y manténgalo en hielo.
En una campana de cultivo de tejidos, aspire el medio del tubo cónico de 50 mililitros con una pipeta, dejando las piezas de tejido cortical en el fondo. Agregue 10 mililitros de medio de disociación precalentado con una pipeta de vidrio recubierta y triture el tejido de 10 a 20 veces. Transfiera la suspensión a un vaso de precipitados de 50 mililitros que contenga una pequeña barra de agitación y colóquela en una placa de agitación.
A continuación, retire el vaso de precipitados, colóquelo en un ángulo de 30 grados durante tres minutos para permitir que el tejido se asiente y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros con hielo. Centrifugar el tubo cónico de 50 mililitros a 1000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Reemplace el sobrenadante con medio de crecimiento glial y cuente las células con un hemocitómetro.
Coloque las células a una densidad de un millón en placas tratadas con cultivo celular de 10 centímetros e incube durante 24 horas. A continuación, sustituya el medio por un medio glial nuevo y permita que las células alcancen el 100% de confluencia en un plazo de dos semanas antes de plantarlas para la experimentación. Coloque 100.000 células gliales por pocillo en placas de seis pocillos y permita que alcancen una confluencia del 80% al 100% para la infección priónica in vitro.
Exponga homogeneizados cerebrales diluidos al 20% y PBS a la luz ultravioleta durante 30 minutos. Aspire el medio de la glía a infectar y agregue de 1,5 a 2 mililitros de medio de crecimiento glial con 0,1% de homogeneizado de cerebro normal o priónico por pocillo. Después de 72 horas, retire el medio, lave las células con PBS y agregue el medio de crecimiento glial fresco.
Aspirar cuidadosamente el tejido adiposo en aproximadamente un mililitro de HBSS en una solución de tripsina al 0,25%, utilizando una pipeta serológica. Transfiera el tejido a una placa de Petri de cuatro centímetros que contiene dos mililitros de medio DMEM F-12 con una mezcla de Dnase-1, colagenasa y dispasa. A continuación, corta el tejido adiposo en trozos pequeños con unas tijeras e incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 1,5 horas.
Transfiera el tejido a un tubo cónico de 50 mililitros, triture el tejido y granule la fracción vascular estromal, que aparecerá roja. Después de lavar el pellet con PBS estéril y centrifugar durante tres minutos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio ADMSC. A continuación, pipetea la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo cónico estéril de 50 mililitros, para eliminar el tejido no disociado.
Agregue nueve mililitros de medios ADMSC a un plato tratado con cultivo celular de 10 centímetros. Pipetear la suspensión celular colada en ella e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio al día siguiente y pase las células una vez que alcancen un 80% a 90% de confluencia.
Después de que las células hayan pasado por dos o tres pasajes, vuelva a suspenderlas en tres a 10 mililitros de medio y cuente con un hemocitómetro. Coloque 100.000 células por pocillo en placas de seis pocillos que contengan medios ADMSC e incube durante la noche, como se muestra anteriormente. Al día siguiente, prepare los medios ADMSC para células estimuladas por citocinas con 10 nanogramos por mililitro de TNF-alfa o 200 nanogramos por mililitro de IFN-gamma.
Cree medios ADMSC con una concentración final de 0,1% de homogeneizado cerebral normal o infectado por priones para muestras de control. Aspire los medios viejos, agregue 1,5 mililitros de citocinas o medios que contengan homogeneizado cerebral en los pocillos correspondientes por triplicado y devuelva las placas a la incubadora. A continuación, lavar las células con PBS y aislar el ARN añadiendo 350 microlitros de tampón de lisis con 1%beta-mercaptoetanol a cada pocillo.
Elimine los lisados celulares con un levantador celular y transcriba inversamente 25 nanogramos de ARN por muestra y amplifique el ADN complementario. Placa BV2 microglía a 50.000 células por pocillo o glía primaria mixta a 100.000 células por pocillo en una placa de seis pocillos. Tratar las células BV2 con medios que contengan un 0,1% de homogeneizado cerebral normal o infectado con priones e incubar durante 72 horas.
Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS para eliminar el homogeneizado cerebral restante. Agregue medios frescos a las celdas y devuelva la placa a la incubadora. Para estimular los ADMC, trátelos con 10 nanogramos por mililitro de TNF-alfa durante 24 horas antes de co-cultivar con BV2 o glía mixta.
Lave los ADMC estimulados con PBS tres veces y gire la suspensión de ADMSC como se demostró anteriormente. Reemplace el medio en las células BV2 o glía mixta con dos mililitros por pocillo de medio ADMSC, y coloque insertos para placas de seis pocillos con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros en la mitad de los pocillos. Agregue dos mililitros de medios ADMSC a cada inserto y agregue dos mililitros adicionales de medios a los pocillos que no reciben insertos.
Después de la granulación, vuelva a suspender y cuente los ADMC, agregue de 50, 000 a 100, 000 células a cada inserto e incube. Al final de la incubación, retire y deseche los insertos o reemplácelos en una nueva placa de seis pocillos y lave los insertos dos veces con PBS. Agregue el tampón proporcionado por el kit de aislamiento de ARN a las células gliales mezcladas o BV2 y raspe los pocillos.
