Ensayo de migración de células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo murino

Trate el pasaje dos AdMSC con medios que contengan 10 nanogramos por mililitro de TNF alfa durante 24 horas o sin TNF alfa para células no estimuladas. Después de lavar e incubar las células en medios libres de suero durante cuatro horas, agregue 25, 000 AdMSC a cada inserto e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius. Aspire el contenido del pocillo y del inserto, luego lave dos veces con PBS dejando un mililitro de PBS en cada pocillo.

Con unas pinzas, retire los insertos uno por uno y limpie suave pero minuciosamente la cámara superior con un bastoncillo de algodón para eliminar las células no migradas. Aspire el PBS restante y pipetee 500 microlitros de solución de violeta cristalina en el pocillo y en la cámara superior del inserto. Aspire la solución de violeta cristalina del pocillo y de la cámara superior del inserto después de una hora de incubación.

Después de lavar y limpiar la cámara superior, coloque el inserto en una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de PBS. Usando un microscopio invertido con una cámara, obtenga imágenes de cuatro áreas aleatorias hacia el centro del inserto bajo un objetivo de 10 veces. Cargue las imágenes en el software de procesamiento de imágenes preferido y ajuste el fondo para mejorar el contraste con las celdas teñidas de púrpura.

CLIA infectada con 22L mostró un aumento de la expresión de ARNm para los marcadores inflamatorios CCL2, CCL5 e IL1 beta, y el marcador de astrocitos S100 beta en comparación con los tratados con NBH. El cultivo con AdMSCs disminuyó la expresión de las citocinas inflamatorias CCL2, CCL5 e IL1 beta, pero no del TNF alfa tanto para las células infectadas con MBH como para las 22L. Los BV2 cocultivados con AdMSC mostraron una disminución del ARNm para los marcadores inflamatorios IL1 beta, IL-6, TNF alfa y la proteína del complemento C1qa en las células tratadas con NBH y RML.

Además, las AdMSC disminuyeron el gen de la microglía M1 CD16 y aumentaron el marcador de microglía M2 ARG-1. El ensayo de migración in vitro sugirió que las AdMSC mostraron una migración significativa hacia medios que contenían 1% de RML.