El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel muy importante en el metabolismo y la desintoxicación. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración in vitro, sigue siendo un reto muy grande a largo plazo cultivar hepatocitos in vitro.
Aquí, establecemos los organoides de los hepatocitos a partir de hepatocitos maduros. Mantiene las principales características de los hepatocitos en morfología y función. En este video, presentaremos cómo cultivar y pasar estos organoides y cómo realizar la modificación genética de estos organoides en detalle.
Primero, la perfusión hepática y la digestión. Prepara todas las regiones y los instrumentos y hazlos estériles. Lave el ratón y abra el epidérmico y la piel, y luego trate de encontrar el horno de bolsa del hígado.
Inyecte las agujas en él y luego capture esto. Haga la perfusión a la velocidad de cinco mililitros por minuto, hasta que el hígado se ponga pálido. Cámbielos en el tampón de perfusión, colóquelos con cuidado, observe el hígado, hasta que se ablande.
Por lo general, toma de tres a cinco minutos, luego corte el hígado y póngalos en las placas, y córtelos en trozos pequeños con las tijeras. Pásalo hacia arriba y hacia abajo con frecuencia. Por lo general, toma de 10 a 15 minutos convertirlos en la celda única.
Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo con 10 a 15 minutos y alimentarlos a través del instalador. Conviértelos en las celdas individuales. Recoge todas las células en el tubo de 50 mililitros, y centríbalas, con la velocidad y luego recoge todas las placas por placas.
Trate de mantenerlos siempre en el hielo frío. Haga las suspensiones de una sola celda y cuéntelas con el contador de celdas. Por lo general, los hepatocitos si están contentos, tiene el fluorescente vivo.
La segunda parte, tratamos de sentar las células y hacer el cultivo de organoides. Recogemos todas las suspensiones de células, y contamos las células con un cierto concentro-fusión Y luego mezclamos las. Metrogels. y el medio de código.
Normalmente tomamos, con el medio y los metrogels, en la proporción de 1 a 2 o de 1 a 3. Después de mezclarlos cuidadosamente, los sentamos en las placas de gradiente. Por lo general, agregamos 100 microlitros en el pozo de 24 platos.
Póngalos en la incubadora a la temperatura de 37 grados. Después de 20 minutos, los ponemos hacia adelante con la parte inferior en la parte inferior y luego en el medio. Con dos o tres días de contraataque, solemos ver salir los organoides.
Esta es la imagen típica de nuestros organoides. Por lo general, necesitamos células individuales de organoides si queremos hacer el pasaje o hacer algún método de modificación genética Recogemos todos los organoides de las placas de contraataque con el tampón de lavado de pelaje. Dejamos caer el sobrenadante, luego en el tampón de lavado de la capa en el plato, los mezclamos, así que anímelo hacia arriba y hacia abajo.
Y luego solemos prelavar todas las puntas con el tampón de cintas de lavado. Para evitar todos los organoides, inclíquese sobre las puntas. Y luego, con el, un nuevo lote sobre hielo o sin él, recogemos todos los organoides por centro-fusión.
Los tratamos, hay un conducto para eliminar todos los metrogeles. Después de 20 a 30 minutos de incubación en hielo se retiran todos los metrogeles. Recolectamos todos los organoides limpios y agregamos tripsina para convertirlos en células individuales.
Después de agregar tripsina, tratamos los organoides en la incubadora. Los organoides hepáticos tardan de 5 a 10 minutos en convertirse en células individuales. Agregamos más tampones de lavado para detener la triplatina.
Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo hacia ellos. Para el proceso de opción, puede lavarlos una vez más para eliminar toda la tripsina. Después del lavado por centrofusión, podemos contarlos debajo del contador celular.
A continuación mostraremos cómo hacer transacción o transfección de estos organoides hepatocitos. Primero, etiquete los tubos de lo que hará, y luego haremos la transfección de la vista de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Necesitas, el regente de los hechos lipoílicos domesticando INI MaX.
Añadimos el. controlar y el gen específico siRNA, e incubarlos con el óptimo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y luego, de acuerdo con la concentración celular, agregamos el RAN max y los mezclamos a fondo.
Luego también añadimos el RAN max con el óptimo por separado y los ponemos en hielo. Después de 5 minutos, preparamos una mezcla ran max separada con diferentes siRNAs, RANi de genes específicos y control de II por separado y los mezclamos a fondo. Ponerlos en hielo de nuevo, y luego recogemos todos los organoides, centrofusión lenta, dejamos caer todo el sobrenadante, agregamos el RNAi max, la mezcla de siRNA en esta placa celular y la alimentamos hacia arriba y hacia abajo a fondo.
Brevemente, las células y la etiqueta RNAi max y la mezcla de siRNA se gentrificaron e incubaron durante 4 a 5 horas a 37 grados. Parte final, estos organoides de hepatocitos también podrían estar infectados por el virus Lenti. El mensaje similar se realizó como transfección de siRNA.
El control y los tubos del virus siRNA estaban bien preparados, y el óptimo se agregó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego con las regiones de infección como poly green y luego agregamos diferentes virus Lenti, de acuerdo con la constitución de instrucciones del fabricante. Combine las suspensiones unicelulares en cultivo de organoides y varias partículas en los tubos eppendorf de 1,5 mililitros, Agregue, bueno, mézclelos Coloque esta mezcla y concéntrelos durante 1 hora a 32 grados.
La fusión de concentrado se realizará a 500 G.Y después de 4 a 5 horas de incubación a 37 grados, la suspensión celular se recogerá y se sentará en metrogel. Y ponerlos en la incubadora de nuevo. El órgano en la eficiencia de la formación u otro análisis funcional podría realizarse de 7 a 10 días después.
Aquí están nuestros resultados representativos. En la figura 1A, se podía ver nuestro ALB-Cre Rosa 26-GFP o RFP hepatocitos organoides de ratón. En la figura 1B se pudo ver la señal positiva Ki67 en la tinción, lo que ha demostrado que nuestros organoides hepatocitos están proliferando.
En la figura 2A y 2B aquí hay una expresión génica representativa de nuestra expresión interferente de nuestros genes. Después de la manipulación genética en organoides de hepatocitos, la interferencia efectiva es muy eficiente. Aquí está la figura 2C, se puede ver después de la manipulación genética con tecnología de carsonita en nuestros organoides murinos.
Conclusión, nuestros resultados mostraron que los organoides de los hepatocitos podían expandirse in vitro y manipularse genéticamente. En resumen, en este vídeo mostramos cómo hacer la perfusión hepática y la digestión para conseguir los hepatocitos. Cómo capturar los hepatocitos y pasar los organoides de los hepatocitos.
Asimismo, mostramos cómo hacer la transfección por siRNA y vector o virus Lenti para hacer la modificación de la genética de estos organoides. Además, tenemos dos carencias en nuestros organoides. Primero, no usamos por núcleo o núcleo de piel para hacer puro los hepatocitos.
Y en segundo lugar, creo que se deben intentar más factores de crecimiento y señalización para mejorar el tiempo de crecimiento de los organoides.
