Nuestro protocolo proporciona un método rápido, reproducible y confiable para generar monocapas epiteliales intestinales primarias directas en diferentes superficies con un mínimo de desechos. Las principales ventajas de este protocolo son el bajo consumo de medios y el bajo coste de mantenimiento del cultivo celular. Es un método rápido para realizar pruebas funcionales y aplicaciones rápidas de nivel inferior.
Este protocolo proporcionará la penetración en el estudio de la reparación de la herida, de la barrera de la permeabilidad, y de la migración transepithelial de diversos tipos de la célula. Además, este modelo puede ser útil en la interacción huésped-patógeno, epitelial dañado, y el descubrimiento de fármacos. Para comenzar, agregue 200 microlitros de solución de recubrimiento a cada pozo de una placa de 48 pozos y un portaobjetos de cámara.
Preincubar ambos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante dos horas. Capa 0.4 micrómetros inserciones de membrana celular con 200 microlitros de solución de colágeno. Incube la placa con los insertos de membrana a cuatro grados Centígrados durante 30 minutos, luego transfiéralo a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante dos horas.
Desinfecte un ratón eutanásico con etanol al 70%, luego diseccione el colon desde el recto hasta el ciego con la ayuda de tijeras y entaúntes. Enjuague suavemente las heces con PBS helado en una jeringa de 10 mililitros equipada con una sonda de alimentación de calibre 20. Retire el colon proximal y deslice el colon distal suavemente sobre la sonda de alimentación de calibre 20.
Ate el colon en el extremo del tubo con hilo de sutura de seda 4-0. Invierta el colon de adentro hacia afuera sobre el extremo atado y ate el otro extremo con hilo, luego corte el colon debajo de la punta de la sonda de alimentación usando tijeras quirúrgicas. Abra suavemente el extremo desatado del colon invertido sobre la punta de una jeringa de repetición de 1,25 mililitros con su émbolo.
Deslice el extremo desatado del colon invertido sobre la jeringa y atarlo firmemente con un hilo. Inserte el émbolo en la jeringa e infle el colon hasta que se vea turgent sin arrugas visibles. Coloque la salchicha de colon inflada en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de recuperación celular sobre hielo durante 20 minutos.
Inflar y desinflar el colon una vez cada cinco minutos. Ate el colon inflado debajo de la punta de la jeringa de repetición usando hilo de sutura de seda 4-0. Corte la salchicha de colon de la jeringa de repetición y colóquela en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de EDTA de 50 milimolares durante 40 minutos.
Gire el tubo a cuatro grados Centígrados. Substituya la solución de EDTA con cinco mililitros de tampón de agitación y agite la salchicha manualmente en posición vertical durante dos minutos. Decantar la solución de agitación en un nuevo tubo de 15 mililitros y repetir el paso de agitación hasta que se recoja un total de 10 mililitros de criptas y tampón de agitación.
Contar el número de criptas en 20 microlitros de la suspensión bajo un microscopio y diluir la muestra para obtener la concentración de cinco criptas por microlitro. Centrifugar la muestra de la cripta a 400 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, retire las inserciones de placa y membrana de 48 pozos de la incubadora y colóquenla en el gabinete de bioseguridad.
Aspire la solución de recubrimiento usando una pipeta P200 y deje la placa con la tapa ligeramente desplazada hasta que las celdas estén listas para ser plateadas. Después de la centrifugación de la suspensión de la cripta, retire el tampón de agitación y resuspend el pellet intacto en tres mililitros de medios completos LWRN. Agregue 200 microlitros de criptas a cada pozo de la placa de 48 pozos pre-recubierta y el portaobjetos de la cámara e incube ambos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius.
Al día siguiente, aspirar los medios y añadir medios frescos. Generalmente, las células se vuelven confluentes en 24 a 48 horas. Para las inserciones de membrana de cultivo celular, agregue 200 microlitros de criptas a la parte superior de las inserciones y 600 microlitros de medios LWRN completos a la parte inferior.
Al día siguiente, aspire los medios y agregue medios frescos solo a la cámara superior. Incubar la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Mida la resistencia eléctrica transepitelial todos los días usando un medidor epitelial de voltios/ohmios.
Después de aislar las criptas de un colon murino y verificar la concentración, la suspensión de la cripta se concentró en cinco criptas por microlitro. Los pozos de placa de 48 pozos fueron sometidos a un ensayo de herida por arañazos al llegar a la confluencia celular. Después de 24 horas, la reparación de la herida fue observada indicando que la cultura era sana y viable.
Se lograron valores de nivel más altos cuando se cambió el medio de LWRN a los medios de diferenciación. Además, se observó una disminución de los marcadores ISC y un aumento en los marcadores de diferenciación, lo que indica que las monocapas diferenciadas se generaron con éxito. Además, la aparición de subtipos de células epiteliales diferenciadas cultivadas en diferentes condiciones se mostró por inmunofluorescencia.
Al intentar este protocolo, es importante asegurarse de que el colon no se rompa en ningún momento durante la preparación y permanezca inflado para liberar criptas en una preparación extremadamente limpia. Una vez que se forman las monocapas de células epiteliales intestinales 2d, podemos realizar ensayos de inmunofluorescencia, heridas por arañazos y permeabilidad y otras aplicaciones aguas abajo. Esto proporcionará conocimiento en la cura de heridas, la migración de diferentes tipos de células y los estudios epiteliales de reparación y daño.
