En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros en hielo, combine 10 microlitros del extracto libre de células con cuatro microgramos de ADN plasmídico y 25 microlitros de tampón de síntesis de proteínas libres de células 2X. Prepare hasta un volumen total de 50 microlitros con agua bidestilada para preparar la solución de síntesis de proteínas libres de células. Pesar 0,75 gramos de agarosa y añadirla a 100 mililitros de tampón de agua bidestilada para preparar agarosa al 0,75%.
Calentar en el microondas la agarosa al 0,75% en ráfagas de 30 segundos a alta potencia y pipetear 50 microlitros de agarosa fundida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros o en moldes de la forma deseada. Coloque la agarosa fundida en un bloque de calor ajustado a 50 grados centígrados y deje que la agarosa se enfríe pero no se polimerice. A continuación, mezcle la agarosa fundida con la solución de síntesis de proteínas libres de células pipeteando y agitando con la punta de la pipeta.
Deje que los geles se enfríen a temperatura ambiente y polimericen durante aproximadamente dos minutos. Transfiera la agarosa polimerizada a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con una espátula y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Coloque los hidrogeles ultracongelados a menos 80 grados centígrados durante una hora.
Después de eso, retire las tapas de los tubos de microcentrífuga. Cubra los tubos con una película de cera y perfore la película para permitir que se seque la humedad. Ajuste la temperatura del liofilizador a menos 20 grados centígrados y la presión a 0,1 milibares y liofilice los dispositivos de síntesis de proteínas libres de células durante 18 horas o toda la noche.
Rehidrate los dispositivos liofilizados durante 30 minutos con 50 microlitros de agua bidestilada sin exceso de líquido, y transfiera los geles a una placa negra de microtitulación de 384 pocillos con una espátula. Finalmente, coloque la placa de microtitulación en un lector de placas y use la configuración del lector de placas que se muestra en la pantalla para la detección y el análisis de fluorescencia. En esta figura se muestra la síntesis de proteínas libres de células de eGFP y mCherry en un hidrogel utilizando lisados de células de E. coli.
Los geles de agarosa al 0,75% se prepararon sin plantilla de ADN con cuatro microgramos de eGFP o plantilla de mCherry o con cuatro microgramos de eGFP y plantilla de mCherry. También se muestra una superposición de los dos canales, y la superposición incluye la imagen de contraste de interferencia diferencial. Los resultados confirmaron la coexpresión de mCherry y eGFP en agarosa.
