Los autores agradecen enormemente el apoyo de los premios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) y BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), y del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas - Laboratorios de Ciencia y Tecnología de Defensa EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Los datos que respaldan esta publicación están disponibles en abierto en: 10.25405/data.ncl.22232452. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.

1. Tampón de lisado celular y preparación de medios
<ol><li>Preparación de 2x agar YT+P y medio<ol><li>Prepare 2 agar YT+P midiendo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1M KH2PO4 y 15 g/L de agar. Para el caldo 2x YT+P, siga la composición anterior pero omita el agar.</li>
		<li>Esterilice esterilizando en autoclave el 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del tampón S30A<ol><li>Preparar el tampón S30A con 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato y 25 mL/L de 2 M de Tris, ajustado a pH 7,7 con ácido acético.</li>
		<li>Guarde el tampón S30A a 4 °C durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del tampón S30B<ol><li>Preparar el tampón S30B con 5,88 g/L de Mg-glutamato y 12,195 g/L de K-glutamato, ajustado a pH 8,2 con 2 M Tris.</li>
		<li>Guarde el tampón S30B a 4 °C durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación del lisado celular (protocolo de 4 días)
<ol><li>Día 1<ol><li>Vierta el 2x YT+P en placas de agar suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina.</li>
		<li>Eliminar E. coli a partir de una cepa de glicerol de -80 °C e incubar durante la noche a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Inocular una sola colonia de la placa 2x YT+P en 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado con ampicilina) en un matraz deflector de 1 L.</li>
		<li>Incubar durante 24 h a 37 °C con agitación a 220 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3<ol><li>Medir y registrar la DO600 de los cultivos de 24 h; crecimiento es suficiente a un DE600 de 3-4. NOTA: Tome una alícuota de 1 ml de cultivo bacteriano y realice una dilución seriada con medio (2x caldo YT+P) antes de medir el OD600 nm. Tenga en cuenta el efecto de dilución al calcular el OD600.</li>
		<li>Transfiera el cultivo uniformemente entre botellas de centrífuga preenfriadas de 500 ml.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Durante la centrifugación, complete la preparación del tampón S30A agregando 2 mL/L de DTT de 1 M al tampón S30A previamente preparado, mezclando y manteniendo el tampón en hielo.</li>
		<li>Vuelva a suspender los gránulos celulares en 200 ml de tampón S30A.</li>
		<li>Agite las botellas vigorosamente hasta que todo el gránulo esté completamente solubilizado, manteniendo las células en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.5 a 2.3.7 (ambos inclusive).</li>
		<li>Agregue 40 ml de tampón S30A a cada botella de centrífuga, vuelva a suspender los gránulos y transfiéralos a tubos de centrífuga de 50 ml prepesados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y elimine el sobrenadante residual con una pipeta, manteniéndolo en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>Vuelva a pesar los tubos de centrífuga, registre la nueva masa y calcule la masa de los gránulos.</li>
		<li>Congele rápidamente los gránulos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4<ol><li>Descongele los gránulos en hielo.</li>
		<li>Por 1 g de gránulo, añadir lo siguiente: 1,2 ml de tampón S30A (TDT añadido antes de su uso), 275 μl de inhibidor de la proteasa (8 mM de stock) y 25 μl de lisozima (10 mg/ml de stock).</li>
		<li>Agite vigorosamente hasta que los gránulos estén completamente solubilizados sin grumos restantes, manteniéndolos en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>En tubos de centrífuga de 50 ml, sonicar las suspensiones celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitud y 20 s/40 s de pulsos de encendido/apagado durante 5 minutos de sonicación.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 1 h a 4 °C para granular los restos de la célula.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos de 50 ml.</li>
		<li>Incubar los tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.</li>
		<li>Prepare los materiales de diálisis añadiendo 1 mL/L de DTT 1 M al tampón S30B. Mezcle y agregue 900 ml a un vaso de precipitados estéril de 1 l. Agregue un agitador magnético y manténgalo a 4 ° C.</li>
		<li>Después de la reacción de escorrentía, transfiera el extracto celular del paso 2.4.7 a tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugue a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolide el sobrenadante sin gránulos en hielo en un tubo de centrífuga de 50 ml.</li>
		<li>Determine el volumen total de extracto celular producido e hidrate el número necesario de casetes de diálisis MWCO de 10K sumergiéndolos en S30B durante 2 min.</li>
		<li>Cargue los casetes a través de una jeringa con hasta 3 ml de extracto. Diálisar hasta tres casetes por vaso de precipitados de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.</li>
		<li>Una vez completada la diálisis, que clarifica el extracto, transfiera el extracto a tubos de microcentrífuga de 2 ml. Centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolide el extracto clarificado en un tubo de centrífuga nuevo sobre hielo y haga un vórtice brevemente para mezclar.</li>
		<li>Determine la concentración de proteínas del extracto con un fluorómetro.</li>
		<li>Diluir el extracto a una concentración de 44,5 mg/mL utilizando ddH2O preenfriado.</li>
		<li>Alícuota en alícuotas de 200 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación de hidrogeles liofilizados (Método A)
<ol><li>Pesar 0,75 g de agarosa, añadir ddH2O a un volumen de 100 ml y calentar en el microondas en ráfagas de 30 s a altas temperaturas para crear un caldo de agarosa fundido.</li>
	<li>Con una pipeta, transfiera 50 μL de agarosa fundida a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y deje que el gel polimerice durante 20-30 min (la polimerización se produce más rápido si los geles se transfieren a un refrigerador).</li>
	<li>Congele rápidamente los tubos de microcentrífuga, que contienen los geles polimerizados, en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Retire la tapa de los tubos de la centrífuga, cubra las aberturas de los tubos de la centrífuga con una película de cera y perfore la película varias veces con una aguja o punta de pipeta.</li>
	<li>Transfiera los tubos de microcentrífuga que contienen los geles polimerizados a un almacenamiento de -80 °C durante 1-2 h.</li>
	<li>Recupere los tubos de centrífuga del almacenamiento a -80 °C y colóquelos en un liofilizador, asegurándose de que los tubos estén completamente secos.</li>
	<li>Acople el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar.</li>
	<li>Deja que el gel se liofilice durante la noche.</li>
	<li>Recupere los geles del liofilizador y colóquelos en almacenamiento a -80 °C hasta que sea necesario. NOTA: Los geles se pueden almacenar liofilizados hasta por 1 año.</li>
</ol>4. Preparación del stock de solución energética 14x
<ol><li>Combine todos los componentes de la reacción (Tabla 1) en un tubo de centrífuga de 15 ml sobre hielo para producir una solución energética 14x.</li>
	<li>Aliquotar la solución de energía 14x en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -80 °C (se pueden utilizar alícuotas de menor volumen). NOTA: La solución energética 14x puede almacenarse durante varios meses a -80 °C si se evita la congelación y descongelación repetida de los tubos.</li>
</ol>5. Preparación del caldo de aminoácidos 4x
<ol><li>Descongele, con hielo, los 20 componentes de aminoácidos de un kit RTS Amino Acid Sampler. Agita los aminoácidos para asegurarte de que se disuelvan por completo.</li>
	<li>En un tubo de centrífuga de 50 ml, combine los 20 aminoácidos y agregue 12 ml de ddH2O. Vortex estéril hasta que la solución se vuelva clara, con solo una ligera neblina de coloración blanca.</li>
	<li>Alícuota los 4x aminoácidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (alícuotas de 500 μL).</li>
	<li>Congele rápidamente las alícuotas de la solución de aminoácidos 4x en nitrógeno líquido y mueva las alícuotas al almacenamiento de -80 °C.</li>
</ol>6. Calibración de tampón libre de células
NOTA: El tampón CFPS utilizado para las reacciones de hidrogel se calibró para concentraciones óptimas de DTT, Mg-glutamato y K-glutamato siguiendo el protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. Las composiciones de las reacciones de calibración se seleccionaron utilizando el método de diseño de experimentos (DOE), seleccionándose siete niveles de factor para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) y TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). Se utilizó JMP Pro 15 para generar un diseño DOE personalizado (Tabla 2) y realizar el análisis para determinar las concentraciones óptimas de los factores.
<ol><li>Recuperar el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongelar en hielo.</li>
	<li>Descongele las existencias de 4 aminoácidos, 14 soluciones energéticas, 40 % de PEG-8000, ADN plasmídico, 3 M de K-glutamato, 100 mM de Mg-glutamato y 100 mM de DTT en hielo.</li>
	<li>Cree una mezcla maestra de calibración combinando 12,5 μL de los 4 aminoácidos, 3,57 μL de la solución energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 al 40 %, 3 μg de ADN plasmídico y 10 μL de extracto libre de células (44,5 mg/ml), y haga hasta 35 μL por reacción con ddH2O.</li>
	<li>Distribuya los 35 μL de mezcla maestra en los pocillos de una placa de microtitulación negra de 384 pocillos.</li>
	<li>Siguiendo el diseño del DOE, agregue el volumen apropiado de Mg-glutamato, K-glutamato y DTT a cada reacción, junto con ddH2O para hacer que cada reacción sea de hasta 50 μL.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita (para mCherry): excitación: 587 nm, emisión: 610 nm, ancho de banda de longitud de onda: 12 nm, óptica: superior, temperatura: 37 °C, con lecturas de fluorescencia recogidas cada 5 minutos durante 4 h de tiempo total de lectura. Incubar las placas agitándolas en un ajuste pulsado a 60 rpm.</li>
	<li>Cargue los resultados en el diseño JMP DOE y genere un perfil de predicción para determinar los niveles óptimos de concentración para K-glutamato, Mg-glutamato y DTT en función de las variables de respuesta deseadas; En este caso, la fluorescencia máxima y la velocidad de reacción fueron las variables de respuesta.</li>
	<li>Combine los reactivos como se muestra en la Tabla 3 para crear el tampón CFPS 2X</li>
	<li>Alícuota y almacenar a -80 °C</li>
</ol>7. CFPS en hidrogeles liofilizados rehidratados (Método A)
NOTA: Los plásmidos utilizados en las reacciones de CFPS se crearon utilizando componentes del kit de herramientas modular EcoFlex para E. coli36 y descritos en Whitfield et al.11 El mCherry y el eGFP estaban bajo el control del promotor JM23100 constitutivo. Estos componentes están disponibles en Addgene.
<ol><li>Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Recoja el tampón CFPS 2x y el ADN plasmídico, y descongele en hielo.</li>
	<li>Recoja los hidrogeles liofilizados y déjelos alcanzar la temperatura ambiente durante 15 minutos dejando reposar los geles en el banco.</li>
	<li>Transfiera los geles a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, recortando los geles con un bisturí si es necesario para que quepan en los pocillos.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine 10 μl de extracto libre de células con 25 μl de tampón 2x CFPS y 4 μg de ADN plasmídico; hasta un volumen total de 50 μL con ddH2O para crear la solución de CFPS.</li>
	<li>Pipetear la solución de CFPS sobre los hidrogeles liofilizados.</li>
	<li>Deje que los geles se remojen en el sistema CFPS durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Se dispone de resultados representativos en estudios previos31,33.</li>
</ol>8. Síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles desplegables (Método B)
<ol><li>Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Recoja el ADN del plásmido y descongele en hielo.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo, combine 10 μl de extracto libre de células con 3 μg de ADN plasmídico y 25 μl de tampón 2x CFPS, lo que hace un volumen total de 37,5 μl.</li>
	<li>Mida 3 g de agarosa y agréguelo a 100 ml de tampón ddH2O para crear un 3% de agarosa.</li>
	<li>Calienta en el microondas la agarosa al 3% en ráfagas de 30 s a alta potencia.</li>
	<li>Pipetear 12,5 μL de agarosa fundida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contengan una mezcla de CFPS hasta un volumen total de 50 μL.</li>
	<li>Deje que la agarosa fundida se enfríe, pero no se polimerice, dejando la agarosa en un bloque térmico ajustado a 50 °C.</li>
	<li>Combine la agarosa fundida con la solución de CFPS; mezcle mediante pipeteo y agitación con la punta, y asegúrese de moverse rápidamente para evitar la polimerización en gel antes de que se pueda mezclar la solución de CFPS.</li>
	<li>Deje que los geles se enfríen a temperatura ambiente y polimericen durante aproximadamente 2 minutos.</li>
	<li>Transfiera la agarosa polimerizada a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una espátula y congele rápidamente en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Coloque los hidrogeles ultracongelados en un almacenamiento de -80 °C durante 1 h.</li>
	<li>Recuperar los geles del almacenamiento; Retire las tapas de los tubos de microcentrífuga, cubra los tubos con una película de cera y perfore la película para permitir que se seque la humedad.</li>
	<li>Conecte el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar, liofilización durante 18 h (durante la noche).</li>
	<li>Guarde los dispositivos CFPS liofilizados en un almacenamiento de -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Los dispositivos CFPS liofilizados, con un volumen húmedo aproximado de 50 μL, se pueden rehidratar con 50 μL de ddH2O sin exceso de líquido. La rehidratación dura aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Los resultados representativos están disponibles en publicaciones anteriores31,33.</li>
</ol>

Incorporación de reacciones de CFPS en una variedad de matrices de hidrogel

<ol>
	<li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+in+an+open+world.">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li><li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+beyond+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).</li><li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li><li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li><li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production.">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li><li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems.">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).</li><li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression.">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li><li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., B&#246;ckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies:+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology.">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).</li><li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+hydrogels:+synthesis,+properties,+and+their+applications.">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702 (2020).</li><li>Loo, S. L., V&#225;squez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future.">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials.">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li><li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings:+Status+and+trends.">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).</li><li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+lens+materials:+A+materials+science+perspective.">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261 (2019).</li><li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management.">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li><li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+drug+delivery+systems:+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques.">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).</li><li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems,+tissue+engineering+and+wound+management.">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).</li><li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible,+stimuli-responsive,+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds.">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050 (2020).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications.">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).</li><li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds.">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).</li><li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix.">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiobitsTM+explorer:+A+modular+synthetic+biology+education+kit.">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).</li><li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., Garc&#237;a-Guzm&#225;n, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine.">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li><li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels:+from+material+resources,+properties+to+functional+applications.">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).</li><li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials:+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150 (2020).</li><li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display.">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution.">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels.">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+DNA+hydrogel:+Design,+synthesis+and+applications.">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).</li><li>Howard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Datasets+for+Whitfield+et+al.">Datasets for Whitfield et al.</a> 2020 Chemical Communications. , (2020).</li><li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions.">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoFlex:+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology.">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li><li>Ben&#237;tez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+&#181;-channels.">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel &#181;-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li></ol>

A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión géni...

La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en células 1,2,3. El CFPS se utiliza en un número cada vez mayor de aplicaciones en numerosas disciplinas, incluida la construcción de células artificiales, la creación de prototipos de circuitos genéticos, el desarrollo de biosensores y la producción de metabolitos 4,5,6. El CFPS también ha sido particularmente útil para producir proteínas recombinantes que no pueden expresarse fácilmente en células vivas, como las proteínas propensas a la agregación, las proteínas transmembrana y las proteínas tóxicas 6,7,8.
El CFPS se realiza normalmente en reacciones líquidas. Esto, sin embargo, puede restringir su despliegue en algunas situaciones, ya que cualquier dispositivo líquido libre de células debe estar contenido dentro de un recipiente de reacción. La justificación para el desarrollo de los métodos presentados aquí fue proporcionar protocolos sólidos para incrustar dispositivos de biología sintética libres de células en hidrogeles, no como una plataforma de producción de proteínas per se, sino para permitir el uso de hidrogeles como un chasis físico para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio. El uso de hidrogeles como chasis de CFPS tiene varias ventajas. Los hidrogeles son materiales poliméricos que, a pesar de un alto contenido de agua (a veces superior al 98%), poseen propiedades sólidas 9,10,11. Tienen usos como pastas, lubricantes y adhesivos y están presentes en productos tan diversos como lentes de contacto, apósitos para heridas, cintas adhesivas marinas, enmiendas de suelo y pañales para bebés 9,11,12,13,14. Los hidrogeles también están siendo investigados activamente como vehículos de administración de fármacos 9,15,16,17. Los hidrogeles también pueden ser biocompatibles, biodegradables y poseer algunas respuestas a estímulos propios 9,18,19,20. Por lo tanto, el objetivo aquí es crear una sinergia entre la funcionalidad derivada de la biología molecular y la ciencia de los materiales. Con este fin, se han realizado esfuerzos para integrar la biología sintética libre de células con una variedad de materiales, incluidos el colágeno, la laponita, la poliacrilamida, la fibrina, el péptido PEG y la agarosa 11,21,22, así como para recubrir superficies de vidrio, papel y tela 11,23,24 con dispositivos CFPS. Los protocolos presentados aquí demuestran dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel a macroescala (es decir, >1 mm), utilizando agarosa como material de ejemplo. La agarosa fue elegida debido a su alta capacidad de absorción de agua, propiedades autogelificantes controladas y propiedades mecánicas sintonizables 11,24,25,26. La agarosa también es compatible con CFPS funcionales, es más barata que muchas otras alternativas de hidrogel y es biodegradable, lo que la convierte en una opción atractiva como sistema modelo experimental. Sin embargo, se ha demostrado previamente que estos métodos son apropiados para incorporar CFPS en una gama de hidrogeles alternativos11. Teniendo en cuenta la amplia gama de aplicaciones de los hidrogeles y la funcionalidad de los CFPS, los métodos aquí demostrados pueden proporcionar una base a partir de la cual los investigadores puedan desarrollar materiales de hidrogel biológicamente mejorados adecuados para sus propios fines.
En estudios previos, se han utilizado sistemas de microgel con un rango de tamaño de 1 μm a 400 μm para realizar CFPS en hidrogeles sumergidos en tampón de reacción 23,27,28,29,30,31. Sin embargo, el requisito de sumergir los hidrogeles dentro de tampones de reacción de CFPS limita las oportunidades para su uso como materiales por derecho propio. Los protocolos presentados aquí permiten que las reacciones de CFPS ocurran dentro de los hidrogeles sin la necesidad de sumergir los geles en tampones de reacción. En segundo lugar, el uso de geles a macroescala (entre 2 mm y 10 mm de tamaño) permite el estudio de la interacción física entre los hidrogeles y la expresión génica libre de células. Por ejemplo, con esta técnica, es posible estudiar cómo la matriz de hidrogel afecta a las reacciones de CFPS11 y cómo las reacciones de CFPS pueden afectar a la matriz de hidrogel31. Los tamaños más grandes de los hidrogeles también permiten el desarrollo de nuevos materiales bioprogramables32. Por último, al incorporar las reacciones de CFPS en los hidrogeles, también se reduce potencialmente la necesidad de recipientes de reacción de plástico. Para el despliegue de sensores sin células, esto tiene claras ventajas sobre los dispositivos que dependen de los artículos de plástico. En conjunto, la incorporación de reacciones de CFPS en hidrogeles proporciona varias ventajas para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio.
El objetivo general de los métodos presentados aquí es permitir el funcionamiento de las reacciones de CFPS dentro de matrices de hidrogel. Se muestran dos métodos diferentes para incluir reacciones de producción de proteínas libres de células en materiales de hidrogel a macroescala (Figura 1). En el Método A, los componentes de CFPS se introducen en hidrogeles de agarosa liofilizados para formar un sistema activo. En el Método B, la agarosa fundida se mezcla con los componentes de la reacción CFPS para formar un sistema completo de hidrogel CFPS, que luego se liofiliza y se almacena hasta que se necesita. Estos sistemas se pueden rehidratar con un volumen de agua o tampón y analito para comenzar la reacción.
Este estudio utiliza sistemas basados en lisado de células de Escherichia coli. Estos son algunos de los sistemas experimentales de CFPS más populares, ya que la preparación del lisado de células de E. coli es simple, económica y logra altos rendimientos proteicos. El lisado celular se complementa con los componentes macromoleculares necesarios para realizar la transcripción y la traducción, incluidos los ribosomas, los ARNt, las aminoacil-ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación. En concreto, en este trabajo se demuestra la producción de eGFP y mCherry en hidrogeles de agarosa utilizando lisados de células de E. coli y se monitoriza la aparición de fluorescencia mediante un lector de placas y microscopía confocal. Los resultados representativos para el lector de placas de microtitulación se pueden ver en Whitfield et al.31, y los datos subyacentes están disponibles públicamente 33. Además, la expresión de proteínas fluorescentes a través de los geles se confirma mediante microscopía confocal. Los dos protocolos demostrados en este artículo permiten el ensamblaje y almacenamiento de dispositivos genéticos basados en CFPS en materia con el objetivo final de crear un entorno físico adecuado para la distribución de circuitos de genes libres de células de una manera que apoye el despliegue en el campo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214793B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10752.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Severn Biotech</td>
			<td>30-15-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino Acid Sampler Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BTRABR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J14121.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NG01208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>757551-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD037-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein concentration kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71397-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J23160.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS4323-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MWCO dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120-9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>part no. 101521, 101522, 101527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H-X3R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 384 well microtitre plates</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elga Purelab Chorus</td>
			<td>Elga</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP00532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP license</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15353518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photospectrometer (Biophotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>16713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16384738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12893543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Lux platereader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>OU-04724-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&#176;c meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1657</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogels

Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.

Synthetic biology integrates diverse engineering disciplines to design and engineer biologically based parts, devices, and systems that can perform functions that are not found in nature. Most synthetic biology approaches are still bound to living cells. By contrast, cell-free synthetic biology systems facilitate unprecedented levels of control and freedom in design, enabling increased flexibility and a shortened time for engineering biological systems while eliminating many of the constraints of traditional cell-based gene expression methods1,2,3. CFPS is being used in an increasing number of applications across numerous disciplines, including constructing artificial cells, prototyping genetic circuits, developing biosensors, and producing metabolites4,5,6. CFPS has also been particularly useful for producing recombinant proteins that cannot be readily expressed in living cells, such as aggregation-prone proteins, transmembrane proteins, and toxic proteins6,7,8.
CFPS is typically performed in liquid reactions. This, however, may restrict their deployment in some situations, as any liquid cell-free device must be contained within a reaction vessel. The rationale for the development of the methods presented here was to provide robust protocols for embedding cell-free synthetic biology devices into hydrogels, not as a protein production platform per se but, instead, to allow the use of hydrogels as a physical chassis for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory. The use of hydrogels as CFPS chassis has several advantages. Hydrogels are polymeric materials that, despite a high water content (sometimes in excess of 98%), possess solid properties9,10,11. They have uses as pastes, lubricants, and adhesives and are present in products as diverse as contact lenses, wound dressings, marine adhesive tapes, soil improvers, and baby diapers9,11,12,13,14. Hydrogels are also under active investigation as drug delivery vehicles9,15,16,17. Hydrogels may also be biocompatible, biodegradable, and possess some stimuli responses of their own9,18,19,20. Therefore, the goal here is to create a synergy between molecular biology-derived functionality and materials science. To this end, efforts have been made to integrate cell-free synthetic biology with a range of materials, including collagen, laponite, polyacrylamide, fibrin, PEG-peptide, and agarose11,21,22, as well as to coat surfaces of glass, paper, and cloth11,23,24 with CFPS devices. The protocols presented here demonstrate two methods for embedding CFPS reactions in macro-scale (i.e., &#62;1 mm) hydrogel matrices, using agarose as the exemplar material. Agarose was chosen due to its high water absorption capacity, controlled self-gelling properties, and tuneable mechanical properties11,24,25,26. Agarose also supports functional CFPS, is cheaper than many other hydrogel alternatives, and is biodegradable, making it an attractive choice as an experimental model system. These methods have, however, been previously demonstrated as appropriate for embedding CFPS in a range of alternative hydrogels11. Considering the wide range of applications of hydrogels and the functionality of CFPS, the methods demonstrated here can provide a basis from which researchers are able to develop biologically enhanced hydrogel materials suited to their own ends.
In previous studies, microgel systems with a size range of 1 &#181;m to 400 &#181;m have been used to perform CFPS in hydrogels submerged in reaction buffer23,27,28,29,30,31. The requirement to submerge hydrogels within CFPS reaction buffers, however, limits opportunities for their deployment as materials in their own right. The protocols presented here allow CFPS reactions to occur within hydrogels without the need to submerge the gels in reaction buffers. Second, the use of macroscale gels (between 2 mm and 10 mm in size) allows the study of the physical interaction between hydrogels and cell-free gene expression. For example, with this technique, it is possible to study how the hydrogel matrix affects CFPS reactions11 and how CFPS reactions can impact the hydrogel matrix31. Larger sizes of hydrogels also allow for the development of novel, bio-programmable materials32. Finally, by embedding CFPS reactions into hydrogels, there is also a potential reduction in the requirement for plastic reaction vessels. For the deployment of cell-free sensors, this has clear advantages over devices dependent on plasticware. Taken together, embedding CFPS reactions in hydrogels provides several advantages for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory.
The overall goal of the methods presented here is to allow the operation of CFPS reactions within hydrogel matrices. Two different methods are demonstrated for embedding cell-free protein production reactions in macro-scale hydrogel materials (Figure 1). In Method A, CFPS components are introduced to lyophilized agarose hydrogels to form an active system. In Method B, molten agarose is mixed with CFPS reaction components to form a complete CFPS hydrogel system, which is then lyophilized and stored until needed. These systems can be rehydrated with a volume of water or buffer and analyte to commence the reaction.
This study uses Escherichia coli cell lysate-based systems. These are some of the most popular experimental CFPS systems, as E. coli cell lysate preparation is simple, inexpensive, and achieves high protein yields. The cell lysate is complemented with the macromolecular components needed to perform transcription and translation, including ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, and initiation, elongation, and termination factors. Specifically, this paper demonstrates the production of eGFP and mCherry in agarose hydrogels using E. coli cell lysates and monitors the appearance of fluorescence using a plate reader and confocal microscopy. Representative results for the microtiter plate reader can be seen in Whitfield et al.31, and the underlying data are publicly available33. Further, the expression of fluorescent proteins throughout the gels is confirmed using confocal microscopy. The two protocols demonstrated in this paper allow for the assembly and storage of CFPS-based genetic devices in materia with the ultimate goal of creating a suitable physical environment for the distribution of cell-free gene circuitry in a manner supportive of field deployment.

Autor destacado: Un enfoque novedoso para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles 

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

We know living systems continuously integrate information from many different sources and that these signals trigger complex and subtle responses. Much of this information processing occurs at the molecular level. We're interested in operating these processes within materials, but without cells.The purpose is to give materials novel functionality. Challenges in this work are primarily associated with the cell-free protein synthesis reaction, rather than working with hydrogel. Cell reaction require high quality cell lysate as well as high quality and purity DNA to function well.This protocol allows researchers to embed molecular biology reactions into a physical biodegradable material that can be taken outside of the laboratory. Also, because the reaction output interacts directly with the material chassis, there is potential for the development of materials with novel sensing and response capabilities. In short-term, we see these methods as providing a novel route to the deployment of cell-free diagnostic devices.This protocol allows a number of devices to be created and spatially organized in a manner that is not possible for liquid reactions. Our future interests are twofold. First, we are interested in expanding the nature of the hydrogels we use to bring more material functionality to the work.Second, we are interested in increasing the complexity and performance of the gene networks we operate in gels, expanding the biological functionality of these systems.

Este protocolo detalla dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel, con la Figura 1 presentando una descripción general esquemática de los dos enfoques. Ambos métodos son susceptibles de liofilización y almacenamiento a largo plazo. El método A es la metodología más utilizada por dos razones. En primer lugar, se ha demostrado que es el método más aplicable para trabajar con una variedad de materiales de hidrogel11. En segundo lugar...

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Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Sabemos que los sistemas vivos integran continuamente información de muchas fuentes diferentes y que estas señales desencadenan respuestas complejas y sutiles. Gran parte de este procesamiento de la información se produce a nivel molecular. Estamos interesados en operar estos procesos dentro de los materiales, pero sin células.El propósito es dar a los materiales una funcionalidad novedosa. Los desafíos en este trabajo se asocian principalmente con la reacción de síntesis de proteínas libres de células, en lugar de trabajar con hidrogel. La reacción celular requiere lisado celular de alta calidad, así como ADN de alta calidad y pureza para funcionar bien.Este protocolo permite a los investigadores incrustar reacciones de biología molecular en un material físico biodegradable que se puede llevar fuera del laboratorio. Además, debido a que la salida de la reacción interactúa directamente con el chasis del material, existe potencial para el desarrollo de materiales con nuevas capacidades de detección y respuesta. A corto plazo, consideramos que estos métodos proporcionan una nueva ruta para el despliegue de dispositivos de diagnóstico libres de células.Este protocolo permite crear una serie de dispositivos y organizarlos espacialmente de una manera que no es posible para las reacciones líquidas. Nuestros intereses futuros son dobles. En primer lugar, estamos interesados en ampliar la naturaleza de los hidrogeles que utilizamos para aportar más funcionalidad material al trabajo.En segundo lugar, estamos interesados en aumentar la complejidad y el rendimiento de las redes de genes que operamos en geles, ampliando la funcionalidad biológica de estos sistemas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

869 vistas.  Newcastle University. Sabemos que los sistemas vivos integran continuamente información de muchas fuentes diferentes y que estas señales desencadenan respuestas complejas y sutiles. Gran parte de este procesamiento de la información se produce a nivel molecular. Estamos interesados en operar estos procesos dentro de los materiales, pero sin células.El propósito es dar a los materiales una funcionalidad novedosa. Los desafíos en este trabajo se asocian principalmente con la reacción de síntesis de pr...

Video: Autor destacado: Un enfoque novedoso para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles 

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Investigación

Biología

Cell-Free Protein Synthesis in Rehydrated Lyophilized Hydrogels

To begin, transfer the hydrogels to 1.5 milliliter micro centrifuge tubes, trimming the gels with a scalpel if necessary to make them fit in the wells. In another 1.5 milliliter micro centrifuge tube, combine 10 microliters of the cell-free extract with 25 microliters of two x cell-free protein synthesis buffer and four micrograms of plasmid DNA. Make up to a total volume of 50 microliters with double distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution.Pipette the solution onto the freeze dried hydrogels, and allow the gels to soak in the cell-free protein synthesis system for five to 10 minutes at room temperature. Transfer the gels to a black 384 well microtiter plate using a spatula. Then, transfer the microtiter plate to a plate reader, and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis.

Síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles liofilizados rehidratados

Cell-Free Protein Synthesis in Deployable Hydrogels

In a 1.5 milliliter microcentrifuge tube on ice, combine 10 microliters of the cell-free extract with four micrograms of plasmid DNA and 25 microliters of 2X cell-free protein synthesis buffer. Make up to a total volume of 50 microliters with double-distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution. Weigh 0.75 grams of agarose and add it to 100 milliliters of double-distilled water buffer to prepare 0.75%agarose.Microwave the 0.75%agarose in 30-second bursts at high power and pipette 50 microliters of the molten agarose into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes or into molds of a desired shape. Place the molten agarose on a heat block set to 50 degrees Celsius and allow the agarose to cool but not polymerize. Then, mix the molten agarose with the cell-free protein synthesis solution by pipetting and stirring with the pipette tip.Allow the gels to cool to room temperature and polymerize for approximately two minutes. Transfer the polymerized agarose to 1.5-milliliter microcentrifuge tubes with a spatula and flash freeze in liquid nitrogen. Place the flash-frozen hydrogels into minus 80 degrees Celsius storage for one hour.After that, remove the microcentrifuge tube lids. Cover the tubes with a wax film and pierce the film to allow the moisture to be dried off. Set the temperature of the freeze dryer to minus 20 degrees Celsius and pressure to 0.1 millibars and freeze-dry the cell-free protein synthesis devices for 18 hours or overnight.Rehydrate the freeze-dried devices for 30 minutes with 50 microliters of double-distilled water without excess liquid, and transfer the gels to a black 384-well microtiter plate using a spatula. Finally, place the microtiter plate on a plate reader and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis. The cell-free protein synthesis of eGFP and mCherry in a hydrogel using E.coli cell lysates is shown in this figure.0.75%agarose gels were prepared without DNA template with four micrograms of either eGFP or mCherry template or with four micrograms of both eGFP and mCherry template. An overlay of the two channels is also shown, and the overlay includes the differential interference contrast image. The results confirmed the co-expression of both mCherry and eGFP in agarose.