Para comenzar, prepare el equipo encendiendo el respirómetro de alta resolución y conéctelo al software de respirometría VatLab para la adquisición y análisis de datos. Reemplace el etanol al 70% en la cámara del oxígrafo con agua bidestilada. Con una barra de agitación magnética, revuélvala continuamente a 750 RPM en la cámara.
Déjalo reposar durante 10 minutos y luego aspira el agua. Lave la cámara tres veces con agua destilada doble durante cinco minutos cada una. Para calibrar los sensores de oxígeno, primero retire el agua destilada doble y pipetee dos mililitros del medio de preparación celular en la cámara.
Coloque los tapones dejando una burbuja de intercambio de aire. Para registrar los valores de calibración de oxígeno, ajuste la configuración, como la ganancia del sensor, el voltaje de polarización y el intervalo de registro de datos. A continuación, etiquete el experimento e introduzca el medio.
Haga clic en el diseño y seleccione 01 Experimento de calibración GR3 Temp. Agite el medio con la barra de agitación a 750 RPM durante al menos 30 minutos a 37 grados Celsius y controle el rendimiento de la membrana del sensor. Manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón y la tecla Mayús, arrastre el ratón para seleccionar un área en la que el cambio en la concentración de oxígeno sea estable.
Luego haga clic en oxígrafo y luego en Calibración de O2. En la calibración de aire, cambie la marca seleccionada a la región seleccionada anteriormente. A continuación, haga clic en calibrar y copiar en el portapapeles.
Detenga la grabación y guárdela haciendo clic en el oxígrafo. Seguido de OK Control y luego guardar y desconectar. A continuación, para realizar la evaluación respiratoria, abra la cámara y aspire el medio en su interior.
Cargar espermatozoides en un volumen final de dos mililitros de MRM para el análisis de células permeabilizadas. Cargue la calibración haciendo doble clic en el cuadro de calibre POS en la esquina inferior y abriendo la calibración realizada anteriormente. A continuación, detenga el experimento.
Inyectar 4,5 microlitros de digitonina de 10 milimolares y permeabilizar las células durante cinco minutos. Registre la respiración de las células intactas durante al menos cinco minutos hasta que se obtenga una señal estable. Luego agregue los sustratos para el complejo I o el complejo II.Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice.
A continuación, inyecte cinco microlitros de ADP 0,5 molar y mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice. Agregue un microlitro de cuatro miligramos por mililitro de oligomicina, que es un inhibidor de la ATP sintetasa. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal disminuya y se estabilice.
Valorar añadiendo un microlitro de FCCP en pasos sucesivos, comenzando desde 0,1 milimolar hasta un milimolar hasta alcanzar una frecuencia respiratoria máxima desacoplada. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice. Deje de inyectarse la droga cuando el consumo de oxígeno comience a disminuir.
Finalmente, inyecte un microlitro de un milimolar de rotenona para el complejo I o cinco milimolares de antimicina A para el complejo II para discriminar entre el consumo de oxígeno mitocondrial y residual. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal disminuya y se estabilice. Para realizar el análisis de datos, seleccione las regiones donde el flujo de oxígeno por volumen correlacionado sea estable después de la inyección de un sustrato o inhibidor, haga clic en marcas, luego en ventanas de estadísticas y exporte los datos.
Normalizar los datos obtenidos por 1 millón de espermatozoides y restar el consumo de oxígeno no mitocondrial de todos los valores. Calcula los índices usando estas ecuaciones. Se logró el registro exitoso de espermatozoides intactos de una muestra de semen donde la línea azul mostraba la concentración de oxígeno y la línea roja representaba el flujo de oxígeno por volumen correlacionado.
Los recuentos más bajos de espermatozoides dieron como resultado un menor consumo de oxígeno basal. Además, mediante este protocolo se obtuvieron curvas de consumo de oxígeno específicas para el complejo mitocondrial I o el complejo II.
