Para empezar, lavar las pequeñas vesículas extracelulares aisladas o SEV dos veces por ultracentrifugación a 110.000 G y cuatro grados centígrados durante 70 minutos. Vuelva a suspender las vesículas en 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Luego, agréguele cinco microlitros de inhibidor de la proteasa 100X.
Someta la muestra a trituración ultrasónica a 40 vatios durante 10 minutos, con un tiempo ultrasónico de tres segundos y un tiempo de intervalo de cinco segundos. Centrifugar la mezcla triturada a 13.700 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Al sobrenadante obtenido, añadir ditiotreitol hasta una concentración final de 50 milimolares.
E incubarlo al baño maría a 56 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 50 microlitros de yodoacetamida molar al sobrenadante. Y deje que reaccione a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
Centrifugar la mezcla a 13, 700 G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Y transfiera el sobrenadante que contiene el extracto peptídico crudo a un tubo ultracentrífugo de 10 kilodalton. Eliminar la proteína del péptido crudo centrifugando el tubo de ultrafiltración a 13, 700 G y cuatro grados centígrados durante una hora.
Secar el efluente recogido en un concentrador centrífugo de vacío a 45 grados centígrados. Para la desalinización, utilice agua pura de grado de espectrometría de masas como disolvente para todos los reactivos. En primer lugar, disuelva los péptidos secos en 100 microlitros de ácido trifluoracético al 0,1% o TFA, y déjelo a un lado.
Luego agregue 100 microlitros de acetonitrilo puro a cada columna de desalinización. Centrifugar las columnas a 400 G durante tres minutos a temperatura ambiente y desechar el efluente. Luego agregue 100 microlitros de acetonitrilo al 50% por columna de desalinización y repita la centrifugación como se mencionó anteriormente antes de desechar el efluente.
A continuación, agregue 100 microlitros de 0.1% TFA a cada columna de desalinización antes de centrifugar como se mencionó anteriormente. Una vez más, deseche el efluente. Ahora, pipetee los péptidos de desalinización en la columna de desalinización.
Centrifugar las columnas como se mencionó anteriormente para cargar la muestra. Vuelva a añadir el efluente recuperado a la columna de desalinización para repetir la carga. A continuación, añade 100 microlitros de 0,1%TFA.
Centrifugar como se mencionó anteriormente y desechar el efluente. Por último, añadir 50 microlitros de acetonitrilo al 50% que contengan un 0,1% de TFA al péptido de la columna de desalinización. Después de la centrifusión, como se mencionó anteriormente, recoja el efluente en un nuevo tubo de centrífuga de grado de espectrometría de masas.
