Para empezar, centrifugar FBS durante la noche en una ultracentrífuga a 110.000 G y cuatro grados Celsius para eliminar los sEV endógenos. Esterilice el sobrenadante filtrándolo a través de una membrana de ultrafiltración de 0,2 micras para producir FBS libre de sEV. A continuación, en una placa de cultivo de 150 milímetros, coloque aproximadamente 3 veces 10 hasta el séptimo macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea en 20 mililitros de medio de cultivo DMEM.
Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante la noche antes de recolectar los sEV de los macrófagos. Al día siguiente, después de desechar el medio, lave las células con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Reemplace el medio con DMEM que contenga un 10% de suero bovino fetal libre libre de sEV antes de incubar las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
En función de los requisitos del experimento, recoja y transfiera el sobrenadante de las células a tubos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar los tubos a 300 G durante 10 minutos para eliminar las células. Transfiera el resultado en sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros y deseche el gránulo.
Esta vez, centrifuga el sobrenadante a 2000 G durante 10 minutos para eliminar las células muertas. A continuación, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de centrífuga de alta velocidad y deseche los gránulos. A continuación, para eliminar los residuos y las microvesículas, centrifugar el sobrenadante obtenido a 10.000 G durante 30 minutos utilizando una centrífuga de alta velocidad.
Transfiera el sobrenadante resultante a nuevos tubos de ultracentrífuga agregando 35 mililitros en cada tubo y desechando los gránulos. Centrifugar los tubos de ultracentrífuga en una centrífuga de rotor de cangilón oscilante a 110.000 G durante 70 minutos antes de desechar el sobrenadante. Lave el pellet enriquecido con sEV crudo resultante con un mililitro de PBS.
De nuevo, añade un mililitro de PBS al gránulo lavado en uno de los tubos, y mezcla pipeteando continuamente. Transfiera el mililitro de la suspensión de PBS resultante a otro tubo que contenga el gránulo y repita lo mismo hasta que todos los gránulos de los tubos se mezclen mediante pipeteo. Transfiera el mililitro resultante de PBS rico en sEV a un nuevo tubo de ultracentrífuga.
A continuación, centrifugar el nuevo tubo en una ultracentrífuga de sobremesa a 110.000 G durante 70 minutos. Después de desechar el sobrenadante, lave el gránulo enriquecido con sEV crudo resultante con 100 microlitros de PBS. Agregue 1,2 mililitros de solución de preparación de proteínas en un tubo de proteína estándar para disolver los 30 miligramos de BSA presentes en él.
Diluir la solución estándar de proteína resultante con PBS para reducir su concentración de 25 a 0,5 miligramos por mililitro. Agregue ocho volúmenes diferentes de la solución estándar de proteína diluida en pocillos de una placa de 96 pocillos y lleve el volumen a 20 microlitros en cada pocillo usando PBB. Agregue 18 microlitros de tampón de lisis HEPES a los pocillos de muestra, seguido de la adición de dos microlitros de las muestras de sEV.
A continuación, agregue 200 microlitros de solución de trabajo de BCA preparada según las instrucciones del fabricante en cada pocillo. Deje reposar el plato a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Por último, mida la absorbancia a 562 nanómetros con un lector de microplacas.
Calcular el contenido total de proteínas en los sEV utilizando los resultados obtenidos. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de los sEV aislados mostraron una morfología típica en forma de copa. El análisis de seguimiento de nanopartículas mostró que los sEV aislados se concentraron principalmente a 136 nanómetros.
El Western blot mostró que los sEV aislados estaban significativamente enriquecidos de marcadores de sEVs, incluidos CD9, beta-actina y TSG101. El marcador reticulado endoplásmico GRP94 solo se detectó en el lisado de células enteras. Los resultados indicaron que el método empleado produjo sEVs con un alto nivel de pureza.
