Comience puliendo al fuego tres pipetas de pasto con un quemador Bunsen, creando diámetros decrecientes. A continuación, esterilizar el abdomen de una madre de ratón preñada sacrificada con etanol al 70%. Abra la cavidad abdominal desde la síntesis púbica hasta la apófisis xifoides de la caja torácica.
Ahora, extrae el cuerno uterino de la cavidad abdominal y colócalo en una placa de 100 milímetros llena de solución helada de HBSS. Extraiga y separe todos los embriones del útero lavado con pinzas finas. Decapita rápidamente los embriones de ratones extraídos y coloca las cabezas en una placa de Petri de 60 milímetros llena de HBSS.
Coloque un par de pinzas finas en la cavidad ocular para sujetar el cerebro. Con otro par, pela la piel y el cráneo hasta que el cerebro sea visible. Saca el cerebro de los bulbos olfativos del cráneo y dale la vuelta.
Observa la corteza en el lado ventral y el hipotálamo en el lado dorsal. Use fórceps curvos para extirpar la capa de meninges y vasos sanguíneos hasta que el cerebro se vea blanco y claro, y separe el área hipotalámica del resto del cerebro. Corta el hipotálamo en tres o cuatro trozos pequeños y finos y utiliza una pipeta para transferir los trozos a un tubo de 15 mililitros.
A continuación, llene el tubo con seis mililitros de HBSS. A continuación, añada la Mezcla de Enzimas 1 una vez que el tejido se haya asentado y se haya eliminado el sobrenadante. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos, agitando cada cinco minutos para volver a suspender el tejido.
Ahora, agregue 30 microlitros de Enzyme Mix 2 y disocie el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de pasto de gran diámetro. Después de una incubación adicional de 10 minutos, agregue los 15 microlitros restantes de Enzyme Mix 2. Utilizando dos pipetas pulidas al fuego de diámetro decreciente, pipetee el tejido 10 veces.
Agregue inmediatamente 10 mililitros de HBSS con 0.5% BSA al tubo. A continuación, centrifugar el tubo a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo celular en un mililitro de HBSS con 0,5% de BSA.
