Mientras trabaja bajo una campana de flujo laminar de clase dos, comience lavando secuencialmente los tejidos adiposos perivasculares o PVAT recolectados de ratones dos veces. En primer lugar, el uso de PBS que contiene un 10% de penicilina-estreptomicina y, a continuación, el uso de PBS suplementado con un 1% de penicilina-estreptomicina. Transfiera los pañuelos enjuagados a una placa de Petri estéril de 60 milímetros y agréguele 200 microlitros de solución de digestión.
Con unas tijeras estériles, pica los pañuelos en trozos de un milímetro cúbico. Con la ayuda de unas tijeras estériles, corte la punta de una pipeta de plástico para ensanchar su extremo. A continuación, transfiera la mezcla de tejido picado a un tubo de centrífuga de 15 mililitros utilizando la punta de pipeta de extremo ancho.
Agregue seis mililitros de la solución de digestión a los tejidos para iniciar la digestión. Después de atar el tubo horizontalmente en una rejilla, incubarlo a 37 grados centígrados en un agitador orbital durante 30 a 45 minutos. Cada 5 a 10 minutos, retire el tubo del agitador en la incubadora y agítelo manualmente hacia arriba y hacia abajo vigorosamente.
Pase la mezcla de tejido digerido a través de un colador celular de 70 micras a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enjuague el colador con un volumen igual de medio de cultivo para maximizar el rendimiento celular y apagar la digestión. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo para aislar la fracción vascular del estroma o SVF. Invierta el tubo para desechar el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de PBS. Centrifugar el tubo de nuevo a 1.800 G durante cinco minutos antes de desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo en un volumen adecuado de medio de cultivo. Siembre las células en una placa de 12 pocillos recubierta de colágeno e incube durante la noche a 37 grados centígrados en una atmósfera húmeda con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, elimine los restos celulares y los glóbulos rojos aspirando el medio de cultivo y lavando las células con PBS suplementado con antibióticos precalentado a 37 grados centígrados.
Finalmente, agregue un mililitro de medio de cultivo fresco a cada pocillo y continúe cultivando las células hasta que alcancen la etapa deseada de confluencia.
