Desde el recipiente del biorreactor del tanque agitado, detenga temporalmente el control de temperatura, pH y OD en el controlador del biorreactor y dispense completamente todo el PBS del recipiente a la botella de desechos. Suelde el módulo de filtración de un solo uso a un puerto en la bolsa de almacenamiento de un solo uso de 10 litros. Filtre y transfiera el medio MSC libre de suero completo a la bolsa de almacenamiento.
Ajuste la bomba a una velocidad a 300 RPM. Y dispense un litro de medio de la bolsa de alimentación al recipiente. Detenga la bomba.
Y comience la temperatura de pH y disuelva para HACER nuevamente, según las instrucciones del fabricante. Selle y desconecte el tubo que conecta la retroalimentación al tubo de alimentación. Suelde el tubo de la botella de microportadores dispersos al tubo de alimentación.
Y bombee todo el contenido de la botella al recipiente. A continuación, vuelva a suspender 2,5 veces 10 a las ocho HMC en un medio libre de suero y transfiéralas al frasco vacío que previamente contenía la suspensión del microportador. Agregue medio libre de suero a 500 mililitros en total dentro del frasco y mezcle la suspensión celular.
Bombee todo el contenido de la botella al recipiente. Selle y desconecte el tubo que conecta la botella al tubo de alimentación y luego vuelva a soldar la bolsa de alimentación. Ajuste la configuración de agitación en el controlador para iniciar la inoculación celular a los microtransportadores.
Y establecer un régimen automatizado de suplementos e intercambio de medios. Suelde las bolsas de muestreo desechables al tubo de muestreo. Y recoja muestras en los puntos de tiempo deseados.
En el momento de la recolección de células en el controlador, ajuste la velocidad de agitación a cero para que los microportadores se asienten. Y dispense sobrenadante en el régimen de alimentación, dejando aproximadamente un litro de suspensión de cultivo en el recipiente. Suelde la bolsa que contiene 50 mililitros de solución digestiva recién preparada a 500 mililitros de HBSS para diluirla.
Y bombee toda la solución al recipiente, a través del tubo de alimentación. Ajuste la velocidad de agitación entre 40 y 45 RPM para disolver los microportadores. Después de que los microportadores se hayan disuelto en 40 a 60 minutos, suelde la bolsa de almacenamiento desechable de tres litros al tubo de recolección y bombee completamente la suspensión celular.
Encienda el sistema de procesamiento celular durante la recolección celular. E instale un kit de procesamiento de celdas desechables en el instrumento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Suelde las bolsas de suspensión celular, tampón de lavado y medio de cultivo al kit.
Introduzca los parámetros de funcionamiento e inicie el proceso automatizado de lavado y resuspensión. Recoja la muestra de células de la cámara de centrífuga según lo indicado por los sistemas de procesamiento celular para el cálculo de la densidad celular. Después de contar, reajuste la densidad celular a dos veces 10 a las seis células por mililitro, utilizando el medio libre de suero completo.
Para el proceso de formulación celular en un biorreactor de 15 litros, utilice un tampón de formulación para volver a suspender las células cosechadas. Suelde 250 mililitros de celdas resuspendidas al relleno de celdas. Ensamble el kit de consumibles de llenado y acabado desechable en el sistema de llenado de celdas.
Y encienda el sistema de preenfriamiento, siguiendo las instrucciones del fabricante antes de que las celdas se vuelvan a suspender. Siga las instrucciones del sistema y configúrelo para llenar 30 mililitros por bolsa con un total de 20 bolsas por juego. Suelde el nuevo juego de 20 bolsas de criopreservación al kit de consumibles desechables de llenado y acabado y repita el llenado y acabado hasta que todas las celdas estén alícuotas.
En el caso de las hMSC, se logró una expansión acumulativa de 128 veces con una viabilidad celular superior al 90%La ingesta de glucosa mostró una correlación negativa con la expansión celular, mostrando un metabolismo asociado con el crecimiento celular saludable. Las MSC recién cosechadas conservan marcadores fenotípicos clásicos con más del 95% de expresión para los marcadores positivos y menos del 2% para los negativos. Las células criopreservadas mostraron una buena adhesión, un comportamiento de expansión normal y una forma típica del huso con crecimiento en espiral después de la descongelación y el resiembra en matraces 2D.
Además, las células también mantuvieron su capacidad para diferenciarse en linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos. Esta plataforma también se puede adoptar para cultivar otras células dependientes del anclaje, como las células HEK293T y Vero. Después del proceso de transferencia B2B en el biorreactor de 15 litros, las células HEK293T alcanzaron una concentración celular máxima de 1,68 veces 10 de las siete células por mililitro.
Mientras que las células Vero alcanzaron una concentración de 1,08 veces 10 a las siete células. Ambos tipos de células mantuvieron una alta viabilidad.
