Para comenzar, tome las vesículas submitocondriales de levadura preparadas y centrifugue las vesículas generadas y las mitocondrias intactas restantes a 20.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Las mitocondrias intactas formaron el gránulo mientras que las vesículas permanecen en el sobrenadante. A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación frescos.
Cargue una almohadilla de 0,3 mililitros de solución de sacarosa 2,5 molar en el fondo del tubo utilizando una jeringa de un mililitro equipada con una cánula, y centrifugue a 118.000 G durante 100 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, las vesículas aparecerán como un disco en la parte superior de la almohadilla de sacarosa. Deseche aproximadamente el 90% del sobrenadante.
Para recolectar las vesículas concentradas, vuelva a suspenderlas en el tampón restante, incluida la sacarosa molar de 2,5 molares mediante pipeteo. Transfiera la suspensión a un homogeneizador Dounce helado y homogeneice la suspensión con un alfarero de politetrafluoroetileno con al menos 10 golpes. A continuación, prepare un gradiente escalonado de 11 mililitros con cada capa que contenga 2,2 mililitros de solución de sacarosa.
Calcule la concentración de sacarosa usando esta fórmula. Agregue la concentración más alta de sacarosa al tubo de centrifugación y colóquelo a menos 20 grados centígrados hasta que la capa esté completamente congelada. Mida la concentración de sacarosa de las muestras con un refractómetro.
Si no se dispone de un refractómetro, suponga que la concentración de sacarosa es de 2 molares. Para ajustar la concentración de sacarosa a 0,6 molares, agregue el cóctel apropiado de MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F e inhibidor de la proteasa a pH 7,4. Cargue con cuidado las muestras en el gradiente de sacarosa para evitar la perturbación del gradiente.
Centrifugar las vesículas a 200, 000 G y cuatro grados centígrados durante 12 horas. Si es posible, establezca una aceleración y desaceleración lentas para evitar la interrupción de la pendiente. A continuación, coseche el gradiente de arriba a abajo en fracciones de 700 microlitros, utilizando una pipeta de un mililitro.
Dando como resultado 17 fracciones, lo que proporciona una resolución suficiente. A continuación, realice dos precipitaciones de ácido tricloroacético ejecutadas secuencialmente agregando 200 microlitros de ácido tricloroacético al 72% a las fracciones individuales y mezclando hasta que la solución sea homogénea. Incubar las fracciones durante 30 minutos en hielo y pellet las proteínas precipitadas centrifugando a 20.000 G y cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Deseche el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de solución de ácido tricloroacético al 28%. Mezclar bien y repetir el paso de centrifugación.
Por último, analizar las fracciones mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Aquí se presenta la importancia de la sonicación suave. El marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 se enriqueció en las fracciones tempranas de baja densidad y estuvo prácticamente ausente en las posteriores.
El marcador de membrana interna mitocondrial Tim17 se concentró en fracciones de alta densidad. Por el contrario, la proteína del sitio de contacto Mic60 acumuló infracciones de concentración intermedia de sacarosa, lo que indica la generación exitosa y la posterior separación de las diversas vesículas de membrana. Por el contrario, con condiciones de sonicación más duras, el marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 podría detectarse en fracciones más bajas del gradiente.
Además, hubo una cantidad significativa de infracciones de Tim17 de densidad intermedia.
