M.E.H. agradece a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), proyecto número 413985647, por su apoyo financiero. Los autores agradecen al Dr. Michael Kiebler, de la Universidad Ludwig-Maximilians, Múnich, por su generoso y amplio apoyo. Agradecemos a Walter Neupert por su aporte científico, sus útiles discusiones y su continua inspiración. J.F. agradece a la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de Múnich (LSM) por su apoyo.

1. Tampones y soluciones madre
<ol><li>Prepare una solución de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) 1 M en agua desionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua desionizada, pH 8,0. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar sorbitol 2,4 M en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.</li>
	<li>Preparar 2,5 M de sacarosa en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.</li>
	<li>Prepare 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en isopropanol. Conservar a -20 °C. PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico si se ingiere y causa quemaduras graves en la piel y daños oculares. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.</li>
	<li>Preparar ácido tricloroacético (TCA) al 72% en agua desionizada. Conservar a 4 °C. PRECAUCIÓN: El TCA puede causar irritación respiratoria, quemaduras graves en la piel y daño ocular. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.</li>
	<li>Preparar el tampón SM: 20 mM MOPS y 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.</li>
	<li>Prepare el tampón de hinchamiento: 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH 7,4.</li>
	<li>Prepare los tampones de gradiente de sacarosa: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M y 1,3 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4. NOTA: Todos los tampones se pueden almacenar a 4 °C; sin embargo, se recomienda almacenar los tampones que contienen sacarosa a -20 °C para evitar el crecimiento de hongos. Los inhibidores de la proteasa deben añadirse de nuevo antes de su uso.</li>
</ol>2. Generación de vesículas submitocondriales
<ol><li>Aislar las mitocondrias crudas de levadura frescas de acuerdo con los protocolos establecidos34,35. NOTA: Para este experimento, se aislaron mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae. No es necesaria la generación de mitocondrias puras en gradiente desprovistas de otros orgánulos.</li>
	<li>Resuspender 10 mg de mitocondrias recién aisladas en 1,6 ml de tampón SM (4 °C) mediante pipeteo (Figura 2, paso 1).</li>
	<li>Transfiera la suspensión mitocondrial a un matraz Erlenmeyer de 100 ml preenfriado.</li>
	<li>Agregue lentamente 16 ml de tampón de hinchazón con una pipeta de vidrio de 20 ml. Aplique una agitación suave constante sobre hielo durante la adición. Este tratamiento osmótico da como resultado la absorción de agua en el espacio de la matriz. La hinchazón de la membrana interna mitocondrial alterará la membrana externa. Sin embargo, ambas membranas permanecerán en contacto en los sitios de contacto9 (Figura 2, paso 2).</li>
	<li>Incubar las muestras bajo agitación suave constante durante 30 minutos en hielo.</li>
	<li>Agregue lentamente 5 ml de solución de sacarosa 2,5 M con una pipeta de vidrio de 5 ml para aumentar la concentración de sacarosa en las muestras a aproximadamente 0,55 M. Este tratamiento osmótico da como resultado un flujo de agua de la matriz36. La contracción de la membrana interna tiene como objetivo maximizar su distancia a los fragmentos residuales de la membrana externa. Esto disminuye la probabilidad de generar vesículas híbridas artificiales de membranas internas y externas a través de la sonicación (Figura 2, paso 3).</li>
	<li>Incubar las muestras bajo una agitación suave durante 15 minutos en hielo.</li>
	<li>Sométase las mitocondrias a sonicación para generar vesículas de membrana submitocondrial (Figura 2, paso 4).<ol><li>Transfiera la suspensión mitocondrial a una celda roseta preenfriada.</li>
		<li>Sonicar la suspensión mitocondrial a una amplitud del 10% durante 30 s mientras se enfría la célula roseta en un baño de hielo.</li>
		<li>Deje reposar la suspensión durante 30 s en un baño de hielo.</li>
		<li>Repita los pasos 2.8.2 y 2.8.3 tres veces más. NOTA: Las condiciones de sonicación variarán según el sonicador utilizado. La optimización será necesaria para máquinas individuales. La sonicación demasiado dura conducirá a la formación artificial de vesículas formadas por membranas internas y externas mitocondriales.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Separación de vesículas submitocondriales
<ol><li>Separar las vesículas generadas de las mitocondrias intactas restantes mediante centrifugación a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C. Las mitocondrias intactas se granularán mientras que las vesículas permanecerán en el sobrenadante.</li>
	<li>Concentra la mezcla de vesículas.<ol><li>Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación nuevos.</li>
		<li>Cargue una almohadilla de 0,3 ml de solución de sacarosa 2,5 M en el fondo del tubo utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una cánula de 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifugar a 118.000 x g durante 100 min a 4 °C. NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.</li>
	</ol></li>
	<li>Las vesículas aparecerán como un disco en la parte superior de la almohadilla de sacarosa después de la centrifugación. Deseche aproximadamente el 90% del sobrenadante. Ahora, recoja las vesículas concentradas resuspendiéndolas en el tampón restante, incluida la sacarosa de 2,5 M, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión a un homogeneizador Dounce helado.</li>
	<li>Homogeneizar la suspensión con al menos 10 pasadas utilizando un alfarero de politetrafluoroetileno.</li>
	<li>Prepara el degradado de sacarosa.<ol><li>Para un gradiente escalonado de 11 mL con cinco pasos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4), cada capa tiene 2,2 mL de solución de sacarosa. NOTA: Se recomienda un refractómetro para medir y ajustar las concentraciones de sacarosa; sin embargo, no es esencial. Aplique 10 μL del tampón al refractómetro y detecte los respectivos índices de refracción. El cálculo de la concentración de sacarosa es el siguiente: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1.3333 representa el índice de refracción del agua. 0,048403 es un índice de conversión específico de sacarosa obtenido a partir del escalado lineal de la refractividad molar a la concentración de sacarosa en soluciones acuosas 37.</li>
		<li>Agregue la concentración más alta de sacarosa al tubo de centrifugación y coloque el tubo a -20 °C. Espere hasta que la capa esté completamente congelada antes de aplicar la siguiente. Proceda en consecuencia hasta que se agregue la última capa y almacene los degradados a -20 °C. NOTA: Recuerde transferir los gradientes congelados a 4 °C al iniciar el experimento para permitir que los gradientes se descongelen. Esto tomará aproximadamente 3 h. Para la centrifugación se utilizó un rotor de cangilón basculante con una capacidad de 13,2 ml. Cuando se utiliza un rotor diferente, los volúmenes de paso de gradiente deben adaptarse en consecuencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la concentración de sacarosa de las muestras con un refractómetro. Si no hay acceso a un refractómetro, se podría suponer alternativamente que la concentración de sacarosa es de 2 M. Esta supuesta concentración de sacarosa será la base para el siguiente paso.</li>
	<li>Ajuste la concentración de sacarosa a 0,6 M mediante la adición de una cantidad adecuada de 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de proteasa, pH 7,4. Si la concentración de sacarosa se estima en 2 M en lugar de medirse, se recomienda probar si la concentración es lo suficientemente baja después del ajuste. Aplique una pequeña alícuota de la muestra (aprox. 50 μL) sobre 200 μL de sacarosa 0,8 M en un tubo de ensayo. La muestra debe permanecer encima de la sacarosa 0,8 M.</li>
	<li>Cargue las muestras (aproximadamente 1 ml) en la parte superior del gradiente de sacarosa (guarde el 10% para referencia posterior). Es importante un pipeteo cuidadoso para evitar la alteración del gradiente (Figura 2, paso 5).</li>
	<li>Separar las vesículas por centrifugación a 200.000 x g y 4 °C durante 12 h. Si es posible, ajuste la centrífuga a aceleración y desaceleración lentas para evitar la perturbación del gradiente (Figura 2, paso 6). NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.</li>
	<li>Coseche el gradiente de arriba a abajo en fracciones de 700 μL con una pipeta de 1 mL. Esto dará como resultado 17 fracciones, lo que permite una resolución suficiente.</li>
</ol>4. Análisis de vesículas suzocondriales
<ol><li>Concentrar las proteínas sometiendo cada fracción a dos precipitaciones de TCA38 realizadas secuencialmente para preparar las muestras SDS-PAGE.<ol><li>Añadir 200 μL de TCA al 72% a las fracciones individuales y mezclar hasta que la solución sea homogénea. Incubar las fracciones durante 30 min en hielo, y granular las proteínas precipitadas por centrifugación a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min. Deseche el sobrenadante, agregue 500 μL de solución de TCA al 28 %, mezcle bien y repita el paso de centrifugación.</li>
		<li>Lavar los gránulos con 1 ml de acetona (−20 °C) y centrifugar durante 10 min a 20.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje que los gránulos se sequen al aire. Vuelva a suspender los gránulos en 60 μL de tampón de muestra SDS e incube las muestras durante 5 min a 95 °C. NOTA: Quedará una gran cantidad de sacarosa, particularmente en las fracciones de alta densidad, después de la primera precipitación de TCA. Esto se eliminará a través de la precipitación adicional de TCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizar 20 μL de cada fracción mediante SDS-PÁGINA39 e inmunotransferencia40,41,42,43.</li>
</ol>

Aislamiento de sitios de contacto mitocondrial

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

El subfraccionamiento mitocondrial es un experimento complicado con varios pasos muy complejos. Por lo tanto, nuestro objetivo era mejorar aún más y, hasta cierto punto, simplificar nuestro método establecido32. En este caso, los desafíos eran la necesidad de equipos complicados y altamente especializados, que a menudo son construcciones individuales, y el enorme consumo de tiempo y energía. Con este fin, intentamos eliminar las bombas y las construcciones individuales utilizadas para la fund...

Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca2+ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.
La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía electrónica5. Se demostró que las mitocondrias son orgánulos bastante complejos que constan de dos membranas: la membrana externa mitocondrial y la membrana interna mitocondrial. Así, estas membranas forman dos compartimentos acuosos: el espacio intermembrana y la matriz. La membrana interna mitocondrial se puede dividir aún más en diferentes secciones. La membrana límite interna permanece muy cerca de la membrana externa, y las crestas forman invaginaciones. Las llamadas uniones crista conectan la membrana límite interna y las crestas (Figura 1). Además, las micrografías electrónicas de mitocondrias osmóticamente encogidas revelan que existen sitios en los que las membranas mitocondriales están estrechamente conectadas 6,7. Estos llamados sitios de contacto están formados por complejos proteicos que abarcan las dos membranas (Figura 1). Se cree que estos sitios de interacción son esenciales para la viabilidad celular debido a su importancia para la regulación de la dinámica mitocondrial y la herencia, así como para la transferencia de metabolitos y señales entre el citosol y la matriz8.
El complejo MICOS en la membrana interna mitocondrial es probablemente el complejo formador de sitios de contacto mejor caracterizado y más versátil. MICOS fue descrito en levaduras en 2011, y consta de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 y Mic10. Estos forman un complejo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza en las unionescrista 9,10,11. La deleción de cualquiera de las subunidades centrales, Mic10 o Mic60, conduce a la ausencia de este complejo 9,11, lo que significa que estas dos subunidades son esenciales para la estabilidad de MICOS. Curiosamente, MICOS forma no solo uno, sino múltiples sitios de contacto con varias proteínas y complejos de la membrana externa mitocondrial: el complejo TOM 11,12, el complejo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, el complejo Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 y Miro 17. Esto indica fuertemente que el complejo MICOS está involucrado en varios procesos mitocondriales, como la importación de proteínas, el metabolismo de los fosfolípidos y la generación de la ultraestructura mitocondrial18. Esta última función es probablemente la principal función de MICOS, ya que la ausencia del complejo MICOS inducida a través de la deleción de MIC10 o MIC60 conduce a una ultraestructura mitocondrial anormal que carece prácticamente por completo de crestas regulares. En cambio, las vesículas de membrana interna sin conexión con la membrana límite interna acumulan19, 20. Es importante destacar que MICOS se conserva en forma y función desde la levadura hasta el ser humano21. La asociación de mutaciones en subunidades MICOS con enfermedades humanas graves también enfatiza su importancia para los eucariotas superiores22,23. Aunque MICOS es muy versátil, deben existir sitios de contacto adicionales (según nuestras observaciones no publicadas). De hecho, se han identificado varios otros sitios de contacto, por ejemplo, las maquinarias de fusión mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, que está involucrada en la biosíntesis del fosfolípido mitocondrial específico cardiolipina 27. Recientemente, mejoramos el método que nos llevó a la identificación de MICOS para identificar Cqd1 como parte de un nuevo sitio de contacto formado con el complejo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, este sitio de contacto también parece estar involucrado en múltiples procesos, como la homeostasis de la membrana mitocondrial, el metabolismo de los fosfolípidos y la distribución de la coenzima Q28,29.
En este caso, se utilizó una variación del fraccionamiento de mitocondrias descrito anteriormente 9,30,31,32,33. El tratamiento osmótico de las mitocondrias conduce a la ruptura de la membrana externa mitocondrial y a una contracción del espacio de la matriz, dejando las dos membranas solo muy cerca en los sitios de contacto. Esto permite la generación de vesículas que consisten exclusivamente en la membrana externa mitocondrial o en la membrana interna mitocondrial o en los sitios de contacto de ambas membranas a través de una sonicación suave. Debido a que la membrana interna mitocondrial posee una proporción proteína-lípidos mucho más alta, las vesículas de la membrana interna mitocondrial exhiben una mayor densidad en comparación con las vesículas de la membrana externa mitocondrial. La diferencia de densidad se puede utilizar para separar las vesículas de membrana a través de la centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. Por lo tanto, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se acumulan a bajas concentraciones de sacarosa, mientras que las vesículas de la membrana interna mitocondrial se enriquecen a altas concentraciones de sacarosa. Las vesículas que contienen los sitios de contacto se concentran en concentraciones intermedias de sacarosa (Figura 2). El siguiente protocolo describe en detalle este método mejorado, que requiere menos equipo especializado, tiempo y energía en comparación con el establecido anteriormente32, y proporciona una herramienta útil para la identificación de posibles proteínas en el sitio de contacto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

Las mitocondrias están presentes en prácticamente todas las células eucariotas y realizan funciones esenciales que van mucho más allá de la producción de energía, por ejemplo, la síntesis de grupos de hierro-azufre, lípidos o proteínas, la amortiguación de Ca2+ y la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, la disfunción mitocondrial da lugar a enfermedades humanas graves como el cáncer, la diabetes y la neurodegeneración. Para realizar estas funciones, las mitocondrias tienen que comunicarse con el resto de la célula a través de su envoltura, que consta de dos membranas. Por lo tanto, estas dos membranas tienen que interactuar constantemente. Los sitios de contacto proteico entre las membranas interna y externa mitocondrial son esenciales a este respecto. Hasta el momento, se han identificado varios sitios de contacto. En el método descrito aquí, las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para aislar los sitios de contacto y, por lo tanto, identificar candidatos que califican para proteínas del sitio de contacto. Utilizamos este método para identificar el complejo del sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS), uno de los principales complejos formadores de sitios de contacto en la membrana interna mitocondrial, que se conserva de la levadura a los humanos. Recientemente, mejoramos aún más este método para identificar un nuevo sitio de contacto que consiste en Cqd1 y el complejo Por1-Om14.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

Autor destacado: Desvelando los sitios de contacto mitocondrial y los conocimientos arquitectónicos 

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

Es relativamente fácil separar las membranas internas y externas mitocondriales. Sin embargo, la generación y separación de vesículas que contienen sitios de contacto es mucho más difícil. En nuestra opinión, dos pasos son críticos y esenciales: las condiciones de sonicación y el gradiente utilizado.
Por lo general, se cree que los degradados lineales tienen una mejor resolución en comparación con los degradados escalonados. Sin embargo, su producción reproducible es tediosa y requ...

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Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Nuestro objetivo es comprender la función molecular de los sitios de contacto mitocondrial, permitiendo la comunicación entre las dos membranas mitocondriales. En realidad, este es un requisito previo para comprender la función de la biogénesis mitocondrial y, por lo tanto, la viabilidad celular. Descubrimos un nuevo sitio de contacto entre la membrana interna y externa mitocondrial creado por Cqd1 y Om14-Por1.Nuestros datos sugieren que este sitio podría ayudar en la importación de lípidos como el ácido fosfatídico. A partir de la identificación del complejo MICOS, contribuimos a obtener una comprensión más profunda de cómo se genera la arquitectura de la membrana mitocondrial. Esto nos permitió desarrollar un modelo de trabajo que explica cómo se forman las dos formas de crestas mitocondriales, las laminares y las tubulares.Nuestra investigación se realizó en levaduras en el pasado. Sin embargo, estamos convencidos de que la formación de una arquitectura mitocondrial correcta también es importante para los eucariotas superiores. Por lo tanto, el siguiente paso en nuestra investigación es analizar el papel de los elementos de la arquitectura mitocondrial en modelos más complejos, como las neuronas primarias.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K vistas.  Ludwig-Maximilians University Munich. Nuestro objetivo es comprender la función molecular de los sitios de contacto mitocondrial, permitiendo la comunicación entre las dos membranas mitocondriales. En realidad, este es un requisito previo para comprender la función de la biogénesis mitocondrial y, por lo tanto, la viabilidad celular. Descubrimos un nuevo sitio de contacto entre la membrana interna y externa mitocondrial creado por Cqd1 y Om14-Por1.Nuestros datos sugieren que este sitio podría ayudar en la importación...

Video: Autor destacado: Desvelando los sitios de contacto mitocondrial y los conocimientos arquitectónicos 

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Investigación

Bioquímica

Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Generating Submitochondrial Vesicles from  Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites  

To begin, take 10 milligrams of freshly-isolated crude yeast mitochondria and re-suspend them in 1.6 milliliters of SM buffer at four degrees celsius by pipetting. Then, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cooled 100-milliliter Erlenmeyer flask. Slowly, add 16 milliliters of the swelling buffer, using a 20-milliliter glass pipette while applying constant mild stirring on ice.Incubate the samples under constant mild stirring for 30 minutes on ice. Then, slowly add five milliliters of 2.5-molar sucrose solution using a five-milliliter glass pipette, allowing the inner membrane to shrink. Incubate the samples under mild stirring for 15 minutes on ice.To generate sub-mitochondrial membrane vesicles, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cool rosette cell, and sonicate the suspension at 10%amplitude for 30 seconds while cooling the rosette cell in an ice bath. Rest the suspension for 30 seconds in an ice bath.

Generación de vesículas submitocondriales a partir de mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae para aislar sitios de contacto mitocondrial

Separation and Analysis of Submitochondrial Vesicles to Identify Mitochondrial Contact Site Proteins

To begin, take the prepared yeast sub-mitochondrial vesicles and centrifuge the generated vesicles and remaining intact mitochondria at 20, 000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. The intact mitochondria formed the pellet while the vesicles stay in the supernatant. Next, transfer the supernatant to fresh ultra centrifugation tubes.Load a cushion of 0.3 milliliters of 2.5 molar sucrose solution at the bottom of the tube using a one milliliter syringe equipped with a cannula, and centrifuge at 118, 000 G for 100 minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, the vesicles will appear as a disc on the top of the sucrose cushion. Discard approximately 90%of the supernatant.To harvest the concentrated vesicles, resuspend them in the remaining buffer, including the 2.5 molar sucrose by pipetting. Transfer the suspension to an ice cold Dounce homogenizer and homogenize the suspension using a polytetrafluoroethylene potter with at least 10 strokes. Next, prepare an 11 milliliter step gradient with each layer containing 2.2 milliliters of sucrose solution.Calculate the sucrose concentration using this formula. Add the highest sucrose concentration to the centrifugation tube and place it at minus 20 degrees Celsius until the layer is completely frozen. Measure the sucrose concentration of the samples using a refractometer.If a refractometer is unavailable, assume the sucrose concentration is 2 molar. To adjust the sucrose concentration to 0.6 molars, add the appropriate MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F, and protease inhibitor cocktail at pH 7.4. Carefully load the samples on the sucrose gradient to avoid the disturbance of the gradient.Centrifuge the vesicles at 200, 000 G and four degree Celsius for 12 hours. If possible, set slow acceleration and deceleration to avoid disruption of the gradient. Then harvest the gradient from top to bottom in 700 microliters fractions, using a one milliliter pipette.Resulting in 17 fractions, which provides a sufficient resolution. Next, perform two sequentially executed trichloroacetic acid precipitations by adding 200 microliters of 72%trichloroacetic acid to the individual fractions and mixing until the solution is homogeneous. Incubate the fractions for 30 minutes on ice and pellet the precipitated proteins by centrifuging at 20, 000 G and four degrees Celsius for 20 minutes.Discard the supernatant. Add 500 microliters of 28%trichloroacetic acid solution. Mix well and repeat the centrifugation step.Finally, analyze the fractions by SDS-PAGE and immunoblotting. The importance of mild sonication is presented here. The mitochondrial outer membrane marker Tom40 was enriched in the early low density fractions and was virtually absent in the later ones.The mitochondrial inner membrane marker Tim17 was concentrated in high density fractions. In contrast, the contact site protein Mic60 accumulated infractions of intermediate sucrose concentration, indicating the successful generation and subsequent separation of the various membrane vesicles. In contrast, with harsher sonication conditions, the mitochondrial outer membrane marker Tom40 could be detected in lower fractions of the gradient.Additionally, there was a significant amount of Tim17 infractions of intermediate density.