Comience por extraer el ADN genómico de las hojas de bambú de tipo silvestre e infectadas con Agrobacterium. Amplifique el ADN genómico que contiene el sitio objetivo de los genes objetivo de hojas de bambú silvestres e infectadas con Agrobacterium utilizando las siguientes condiciones de PCR. Después de la PCR, realice la digestión de la enzima endonucleasa preparando una mezcla de reacción que contenga un microlitro de age-1, un microgramo de productos de PCR y un tampón 10X de cinco microlitros.
Luego, agregue agua hasta un volumen final de 50 microlitros. Incubar la mezcla de digestión a 37 grados centígrados durante una hora. Utilizando electroforesis en gel, analice la proporción de fragmentos de ADN digeridos.
Compare los fragmentos digeridos de las muestras de tipo salvaje e infectadas por Agrobacterium para evaluar la eficiencia de la edición de genes. Exponga las plántulas de bambú a condiciones de alta intensidad de luz para aumentar la cantidad de luz absorbida y la activación del sistema de fotoprotección de las hojas. A continuación, encienda el fluorímetro IMAGING-PAM y ajuste la intensidad de la luz actínica para medir la fluorescencia de la clorofila del fotosistema II in vivo de las hojas de bambú.
El color rojo del carril beta producido por el gen RUBY indicó una expresión génica exitosa mediada por Agrobacterium en hojas de bambú. De las cuatro cepas de Agrobacterium, la cepa GV3101 causó la acumulación más significativa de carril beta en las hojas de bambú infectadas. Después de la infección con las construcciones CRISPR-Cas9 y los tratamientos con alta luz, ciertas áreas de las láminas de las hojas mostraron valores de enfriamiento no fotoquímico más bajos.
Además, la digestión enzimática y el análisis de secuenciación confirmaron la mutación exitosa del gen PeVDE en las regiones editadas. Los resultados de la secuenciación de Sanger del fragmento PeVDE después de la edición por sgRNA1 y sgRNA2 mostraron la deleción de un fragmento largo en el gen PeVDE. Después de 30 días de infección por Agrobacterium, las áreas foliares transfectadas con sgRNAs tanto para PeVDE como para PeCCR5 exhibieron valores de enfriamiento no fotoquímico más bajos.
