Para comenzar, coloque el dispositivo micro sim ensamblado en abrazaderas de manguera estériles. Cultive el dispositivo en una placa de Petri grande y estéril. Para mayor humedad, coloque una tapa de tubo cónico de 50 mililitros llena de agua estéril.
Para preparar el dispositivo para el cultivo celular, enjuague la cámara superior con 100 microlitros de agua. A continuación, prepare una solución de recubrimiento mezclando colágeno cuatro, fibronectina bovina y agua estéril. Retire el agua de la cámara superior y agregue 100 microlitros de solución de recubrimiento.
Incubar la cámara a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, reemplace la solución de recubrimiento en la cámara superior con 100 microlitros de HECSR a temperatura ambiente. Agregue 20 microlitros de solución HECSR en la cámara inferior.
Para pasar, las células similares a EECM-BMEC, agregue una mezcla de enzimas de desprendimiento celular a las células e incube a 37 grados centígrados durante cinco a ocho minutos. A continuación, pipetee la suspensión celular y agréguela a cuatro veces el volumen del medio endotelial en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 200G durante cinco minutos y volver a suspender las células en un mililitro de HECSR.
Siembre las células a una densidad de 40.000 células por centímetro cuadrado en la cámara superior e incube a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas para facilitar la adhesión celular. Después de la incubación, intercambie el medio con HECSR fresco en ambas cámaras. Fije las celdas agregando 20 microlitros de metanol al 100%, enfriado a menos 20 grados centígrados en la cámara inferior y 50 microlitros en la cámara superior.
Incube el dispositivo a temperatura ambiente durante dos a 10 minutos. A continuación, lave las células agregando 20 microlitros de PBS en la cámara inferior y 100 microlitros en la cámara superior. Después de cada lavado, confirme la ausencia de burbujas en la cámara inferior.
Bloquee las células durante 30 minutos agregando 20 microlitros de la solución de bloqueo en la cámara inferior y 50 microlitros en la cámara superior. Después del bloqueo, reemplace el volumen en la cámara superior con 50 microlitros de la solución de anticuerpos primarios e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, agregue 50 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios en la cámara superior e incube durante una hora protegido de la luz.
Después del lavado de PBS, agregue 50 microlitros de Hoechst a la cámara superior e incube durante tres minutos. Luego agregue 20 microlitros de PBS a la cámara inferior y 100 microlitros a la cámara superior. Tome imágenes del dispositivo inmediatamente en un microscopio confocal.
Localice la ventana de la membrana utilizando un objetivo húmedo de larga distancia de trabajo 40x y cambie a los canales de fluorescencia para comprobar la tinción de Hoechst y de unión. Aquí se muestran las densidades óptimas de asiento para el cultivo celular HIPSC y el BPLC de semilla. El cocultivo derivado de HIPSC fue más fácil de distinguir en las imágenes de contraste de fase que los cocultivos primarios.
La siembra baja de BPLC da como resultado una cobertura de parásitos deficiente y la aglomeración, mientras que comer en exceso hace que la capa de parásitos se desprenda de la membrana. En el cocultivo celular derivado de HIPSC inmunoteñido, se observaron dos capas de células muy próximas, separadas solo por una delgada nanomembrana de nitruro de silicio. En el ensayo de permeabilidad, la alta variabilidad en la permeabilidad de las células endoteliales cultivadas durante dos días indica que dos días de cultivo fueron insuficientes para la maduración de la barrera.
Además, no hubo diferencias significativas en la permeabilidad entre los laboratorios tras la maduración de barrera a partir de los cuatro días.
