Para empezar, después de adquirir el ARN largo no codificante de interés, incubar el tampón de hibridación a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, disuelva la sonda de densidad óptica en 160 microlitros de agua desionizada tratada con pirocarbonato de dietilo lejos de la luz. Prepare 200 microlitros de la mezcla de la sonda para cada pocillo y configure una serie de 50, 25, 12,5 y seis microgramos por mililitro.
Desnaturalizar la mezcla de la sonda a 73 grados centígrados durante cinco minutos. Tome una placa de cultivo celular de 12 pocillos que contenga células 143B en cubreobjetos de vidrio estériles. Retire el medio y lave dos veces durante cinco minutos con PBS.
Coloque las células en una coctelera. Luego retire el PBS y agregue 200 microlitros de etanol al 100% a cada pocillo, fijando durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego retire el etanol, agregue 200 microlitros de Triton X-100 al 0,1% a cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Retire Triton X-100 al 0,1% y lávese dos veces durante cinco minutos con PBS. A continuación, retire el PBS, agregue 200 microlitros de citrato salino de sodio dos veces o tampón SSC en cada pocillo e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Retire dos veces el tampón SSC, agregue 200 microlitros de etanol al 70% en cada pocillo e incube durante tres minutos a temperatura ambiente.
Deseche el etanol al 70%, luego agregue 200 microlitros de etanol al 85% en cada pocillo e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el etanol al 85%, agregue 200 microlitros de etanol al 100% a cada pocillo e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. Después, absorba y deseche el etanol al 100% y deje que los pocillos se sequen.
A continuación, agregue 200 microlitros de mezcla de sonda desnaturalizada a cada pocillo, luego incube a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire las muestras a 37 grados centígrados, deseche la mezcla de la sonda y agregue 200 microlitros de tampón precalentado 0.4 veces SSC 0.3% Tween 20 a cada pocillo y lave durante dos minutos a temperatura ambiente. Quite el búfer 0,4 veces SSC 0,3%Tween 20.
Agregue 200 microlitros de tampón dos veces SSC 0.1%Tween 20 a cada pocillo y lave durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, descarte el búfer SSC 0.1%Tween 20 de dos veces. Agregue 200 microlitros de solución de tinción DAPI y tiña durante 20 minutos en la oscuridad en una coctelera.
Después de teñir, deseche la solución DAPI y lávela con PBS durante dos minutos a temperatura ambiente. Por último, agregue 50 microlitros de medio de montaje que contenga goma de mascar a la guía y coloque la cubierta de vidrio para fijar la guía. Se muestran imágenes representativas de SNHG6 FISH en células de osteosarcoma humano.
La sonda SNHG6 marcada con Cy3, que emite fluorescencia roja, mostró que SNHG6 se localiza principalmente en el citoplasma. Se observó un color de fondo cuando se utilizó una alta concentración de sonda.
