Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600); (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408); (3) Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Transformación Industrial de Preparación de MTC Hospitalaria; (4) Proyectos de investigación dentro del presupuesto de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (2021LK047).

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. La Figura 1 muestra el protocolo general para ARN FISH; La Tabla 1 contiene la composición de todas las soluciones y la Tabla 2 contiene las secuencias de cebadores utilizadas en este protocolo.
1. Preparación de la sonda
<ol><li>Identificar y adquirir la secuencia FASTA de un lncRNA diana de interés, por ejemplo, de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Siguiendo las indicaciones del sitio web, diseñe las sondas ISH en línea19 y revise las sugerencias del algoritmo de diseño para enumerar las sondas que se pedirán con la etiqueta Cy3.</li>
	<li>Incubar el tampón de hibridación a 37 °C durante 2 h de antelación.</li>
	<li>Disuelva 4 sondas de densidad óptica (OD) en 160 μL de ddH2O tratado con dietilpirocarbonato (DEPC) a una concentración de 1 mg/ml lejos de la luz. NOTA: La densidad óptica (DO) representa la unidad de medida del ADN y el ARN. Por lo general, 1 unidad OD = 33 μg/mL de ADN.</li>
	<li>Prepare 200 μL de la mezcla de la sonda para cada pocillo (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampón de hibridación, componga el volumen con ddH2 O tratadocon DEPC a 200 μL) y configure una serie de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL y 6 μg/mL. NOTA: La concentración de la sonda debe explorarse experimentalmente de antemano. Una concentración alta de la sonda conducirá a una unión inespecífica de lncRNAs, mientras que una concentración baja de la sonda conducirá a una detección insensible o fallida de lncRNAs.</li>
	<li>Desnaturalizar la mezcla de la sonda a 73 °C durante 5 min. NOTA: Si la sonda de ADN marcada con Cy3 es bicatenaria, desnaturalice la sonda a ADN monocatenario a 95 °C durante 5 minutos, luego enfríe rápidamente durante 2 minutos en hielo.</li>
</ol>2. Preparación celular
<ol><li>Siembre 50.000 células 143B por pocillo en cubreobjetos de vidrio estériles en una placa de cultivo celular de 12 pocillos e incube durante 24 h (37 °C, 5% de CO2) en DMEM. NOTA: El número específico de células sembradas aquí varía con el tamaño de la célula, lo cual es apropiado para que las células sembradas alcancen una confluencia del 50% después de ser incubadas durante 24 h. Los cubreobjetos de vidrio estéril son redondos para ser adecuados para la placa de 12 pocillos.</li>
	<li>Retire el medio y lave durante 2 x 5 minutos con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS). NOTA: Prepare 1x PBS con ddH2O. No se puede usar PBS sin tratamiento con DEPC porque contiene RNasa. Realice todos los pasos siguientes en condiciones libres de RNasa.</li>
	<li>Retire 1x PBS y agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo para fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el etanol, agregue 200 μL de Triton X-100 al 0,1% (en 1x PBS) en cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. NOTA: El tiempo debe controlarse estrictamente con la permeabilización Triton X-100 y no puede ser demasiado largo.</li>
	<li>Retire Triton X-100 al 0,1% y lave 2 x 5 min con 1x PBS. NOTA: Si el protocolo tiene que ser pausado aquí, reemplace el PBS con etanol al 70% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de RNasa) y almacene la muestra a 4 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
	<li>Retirar 1x PBS, añadir 200 μL de tampón de citrato salino sódico (SSC) 2x (dilución de 20x SSC con ddH2O sin RNasa) en cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Retire 2 tampones SSC, agregue 200 μL de etanol al 70% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el etanol al 70%, agregue 200 μL de etanol al 85% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de ARNasa) en cada pocillo e incube durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el etanol al 85%, agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Absorber y desechar etanol al 100%; Deja que los pozos se sequen.</li>
</ol>3. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
<ol><li>Añadir 200 μL de mezcla de sonda (desnaturalizada como en el paso 1.5) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante la noche (16-18 h). NOTA: Existe una fuerte correlación positiva entre la temperatura de hibridación y la concentración de la sonda; Por lo tanto, para optimizar el fondo, se debe reducir tanto la temperatura de hibridación como la concentración de la sonda.</li>
	<li>Al día siguiente, saque muestras a 37 °C y deseche la mezcla de sonda. Añadir 200 μL de tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada pocillo (precalentado a 65 °C) y lavar durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20, agregue 200 μL de tampón 2x SSC/0,1% Tween-20 a cada pocillo y lave durante 2 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar 2x SSC/tampón Tween-20 al 0,1%, añadir 200 μl de solución de tinción 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/ml) y teñir durante 20 minutos lejos de la luz.</li>
	<li>Deseche la solución de tinte DAPI y lave con 1x PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 50 μL de medio de montaje que contenga goma en el portaobjetos y coloque el cubreobjetos de vidrio en el portaobjetos para fijarlo. NOTA: Asegúrese de colocar el cubreobjetos en el portaobjetos con la celda hacia abajo.</li>
	<li>Observar bajo un microscopio de fluorescencia. NOTA: Utilice un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal láser; Este último produce una imagen de mayor sensibilidad y claridad.</li>
</ol>

FISH para la localización de ARN largo no codificante en células de osteosarcoma humano

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNAs en las células, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas en las células, que también se pueden utilizar para detectar la ubicación de lncRNAs en tejidos embebidos en parafina. Sin embargo, el protocolo específico en estos casos es diferente porque los tejidos embebidos en parafina necesitan ser desparafinados21. Este procedimiento experimental se puede aplicar en placas de 48 o 96 pocil...

Nuestra comprensión del genoma humano se ha ampliado enormemente gracias a los recientes avances en la tecnología del genoma completo. Alrededor del 93% del genoma humano se puede transcribir en ARN, pero solo el 2% de los ARN se pueden traducir en proteínas; el 98% restante de los ARN que no tienen función de traducción de proteínas se denominan ARN no codificante (ncRNA)1. Como una clase de ARN no codificantes (ncRNAs), los ncRNAs largos (lncRNAs), que contienen más de 200 nucleótidos2, han atraído cada vez más atención debido a su participación en muchos procesos fisiológicos y patológicos de las células, como la diferenciación, el control del ciclo, la apoptosis, la migración y la invasión 3,4,5. Los LncRNAs desempeñan sus funciones a través de diversos mecanismos, como la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica nuclear, el control del proceso de empalme del ARNm y la modificación postranscripcional6. Los LncRNAs regulan la aparición, el desarrollo y la metástasis de las neoplasias malignas tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. La regulación transcripcional se realiza en el núcleo afectando la transcripción del ARN a través de la unión a las estructuras cromosómicas, mientras que la regulación postranscripcional se realiza en el citoplasma mediante el control de los genes diana a través de un mecanismo endógeno de ARN competitivo (ARNce) 5,7,8. El CeRNA ha revelado un nuevo mecanismo de interacción del ARN, a saber, que los lncRNAs pueden actuar como una esponja para adsorber miRNAs e inhibir la degradación mediada por miRNAsde genes diana relacionados. Por lo tanto, la información sobre la localización subcelular de los lncRNAs, ya sea que un lncRNA específico se encuentre en el citoplasma o en el núcleo, es importante para ayudar a identificar sus funciones biológicas.
En la actualidad, la localización de lncRNA se detecta principalmente mediante dos métodos, uno es mediante el ensayo de aislamiento de la fracción de núcleo/citoplasma y el otro es mediante ARN FISH. En el primero, se extraen los ARN de las fracciones citoplasmática y nuclear respectivamente, y luego se realiza la amplificación por PCR con cebadores específicos de lncRNA para detectar la proporción de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. La ventaja de este método es la eficiencia del tiempo, mientras que la desventaja es que la localización real del lncRNA no se refleja directamente en la proporción relativa de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. RNA FISH puede detectar la localización de lncRNA en las células mediante el diseño de secuencias de cadenas antisentido específicas de lncRNA seguidas de marcaje con colorantes fluorescentes10. Los métodos FISH de ARN se han mejorado con avances en las técnicas de sonda y los métodos de detección, incluidos los conjuntos de sondas de múltiples oligonucleótidosmarcados con fluoróforos 11, las sondas LNA 12 y las sondas de ADN ramificado (ADNb)13. RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNA, sino también detectar la colocalización de otros ARN, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor14.
En este trabajo, hemos incluido como ejemplo el protocolo detallado de detección de localización intracelular del gen huésped de ARN nucleolar pequeño 6 (SNHG6) de lncRNA en células de osteosarcoma (143B) mediante ARN FISH. SNHG6 es un lncRNA de 600-730 nucleótidos en su forma madura empalmada e identificado como un nuevo oncogén en diversos cánceres humanos, incluido el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico, el carcinoma de células claras de ovario, el osteosarcoma y el carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Los estudios han confirmado la participación de SNHG6 en los comportamientos biológicos de las células cancerosas, como la proliferación, la EMT y la autofagia, y han demostrado la localización citoplasmática de SNHG6 donde puede afectar a los genes diana mediante la unión (esponja) de los miRNAs15,16,17. En este documento se presenta este protocolo detallado de detección de la localización intracelular de SNHG6 mediante ARN FISH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Se han estudiado las funciones importantes de los ARN largos no codificantes (ARNnc) en el cáncer, como la regulación de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la migración, la infiltración y la autofagia de las células cancerosas. La detección de localización de lncRNAs en las células puede proporcionar información sobre sus funciones. Mediante el diseño de la secuencia de cadena antisentido específica de lncRNA seguida de marcaje con colorantes fluorescentes, se puede aplicar la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para detectar la localización celular de lncRNAs. Junto con el desarrollo de la microscopía, las técnicas de ARN FISH permiten ahora incluso la visualización de los lncRNAs mal expresados. Este método no solo puede detectar la localización de lncRNAs por sí solo, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor. Aquí, hemos incluido el procedimiento de operación experimental detallado y las precauciones de ARN FISH mediante el uso del gen huésped de ARN nucleolar pequeño de lncRNA 6 (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B) como ejemplo, para proporcionar una referencia para los investigadores que desean realizar experimentos de ARN FISH, especialmente lncRNA FISH.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

Autor destacado: ARN FISH para localizar lncRNA-SNHG6 en células de osteosarcoma 

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

Se muestran imágenes representativas de SNHG6 FISH en células de osteosarcoma humano (Figura 2). El control negativo se trata con la sonda Ctrl negativa; el control positivo se trata con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 y la sonda U6 están marcadas con Cy3, que emite fluorescencia roja. El DAPI es un tinte que tiñe el ADN, que emite fluorescencia azul. Este resultado muestra que SNHG6 se localiza principalmente en el citoplasma, y esta información puede proporciona...

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El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

El objetivo de nuestra investigación es proporcionar un protocolo detallado de ARN FISH que proporcione una referencia para los científicos que quieran realizar experimentos de ARN FISH. Nuestra investigación ha establecido que el ARN FISH se puede utilizar para localizar lncRNA en células de osteosarcoma humano. Nuestro protocolo proporcionó un procedimiento experimental completo y las precauciones para el ARN FISH utilizando lncRNA-SNHG6 en células de osteosarcoma humano como referencia.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K vistas.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. El objetivo de nuestra investigación es proporcionar un protocolo detallado de ARN FISH que proporcione una referencia para los científicos que quieran realizar experimentos de ARN FISH. Nuestra investigación ha establecido que el ARN FISH se puede utilizar para localizar lncRNA en células de osteosarcoma humano. Nuestro protocolo proporcionó un procedimiento experimental completo y las precauciones para el ARN FISH utilizando lncRNA-SNHG6 en células de osteosarcoma humano como referenc...

Video: Autor destacado: ARN FISH para localizar lncRNA-SNHG6 en células de osteosarcoma 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

Investigación

Investigación sobre el cáncer

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.