Para comenzar, coloque las muestras de coágulos de sangre cerebral recolectadas en un plato limpio con unas pinzas. A continuación, con una pipeta, añadimos cinco mililitros de suero fisiológico y agitamos suavemente el plato. Retire la solución salina con una pipeta.
Con unas tijeras, corta los coágulos en trozos pequeños. Una vez más, agregue cinco mililitros de solución salina fisiológica a los coágulos y agite el plato suavemente antes de aspirar la solución salina con una pipeta. Luego, con unas pinzas, transfiera los trozos de coágulos a una placa en U nueva y limpia.
Prepare la solución de trabajo de SFE ajustando la concentración de SFE a 2.000 unidades por mililitro utilizando solución salina fisiológica. Agregue 300 microlitros de la solución de trabajo SFE a los coágulos pretratados. Para iniciar la primera ronda de degradación, incube la mezcla de SFE y coágulos a 37 grados centígrados durante media hora.
Después de eso, agite suavemente para mezclar la muestra tratada con SFE. Y con una pipeta limpia, transfiera la porción líquida a un tubo estéril. Deje a un lado el coágulo restante para otra ronda de degradación.
Centrifugar el líquido recogido a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, con una pipeta, transfiera el sobrenadante o la solución de SFE recuperada a otro tubo limpio. Vuelva a suspender el gránulo celular resultante en 50 microlitros de solución salina fisiológica mezclando suavemente.
Después de esto, realice rondas posteriores de degradación en los coágulos restantes utilizando la solución SFE recuperada como se demostró anteriormente. Reúna la mezcla de células de cada ronda de degradación para preparar la muestra de células sanguíneas. Agregue cinco microlitros de la muestra celular obtenida al portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina.
Y con un cubreobjetos, unta las células. Deje que el líquido se evapore a temperatura ambiente. Para realizar la tinción celular, agregue suavemente 100 microlitros de tinte derecho al frotis celular.
Deja que las células se tiñan durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de enjuagar suavemente el tinte con agua limpia. Por último, examine las células teñidas con un microscopio óptico. Se observaron coágulos de sangre rojos compactos con una solución de trabajo incolora durante la etapa inicial de degradación.
La disolución del coágulo se observó después de una incubación de 30 minutos y una incubación prolongada de hasta cinco horas disolvió la mayoría de los coágulos, mientras que no hubo cambios significativos en el grupo de control negativo, incluso después de una incubación de 10 horas. Después de una tinción correcta, los glóbulos rojos maduros, las plaquetas y varios granulocitos fueron claramente identificables bajo un microscopio óptico. Los componentes celulares pudieron ser analizados cuantitativamente con la ayuda de la autohematología con éxito.
