Rat Retina Excision and Mounting on Porous Membrane for Calcium Imaging

Dos o tres semanas antes de la toma de imágenes, el vítreo del ojo de una rata anestesiada se inyecta con las partículas virales que llevan el indicador de calcio codificado genéticamente. Mediante el uso de la fundoscopia y la OCT, se examina la estructura de la retina en busca de reacciones adversas de la inyección del indicador de calcio. Dos semanas después de la inyección, la capa de células ganglionares o GCL exhibió emisión de fluorescencia.

A continuación, se inicia la extirpación de la retina de la rata sacrificada. Tome los ojos que expresan AAV2-CAG-GCaMP5G y retire todo el tejido que rodea el globo ocular con pinzas pequeñas y curvas y tijeras de resorte finas. A continuación, toma un trozo de papel de filtro de tres por tres centímetros.

Colócalo en la tapa de un plato de 3,5 centímetros y empapa el papel de filtro con medio AIMS. Coloque el globo ocular sobre el papel con el segmento anterior orientado hacia el operador. Use un par de pinzas rectas para sostener el globo ocular en un ángulo de aproximadamente 45 grados con respecto a la superficie del plato.

Use el espacio entre las pinzas rectas para guiar una incisión con una cuchilla. A continuación, sumerja el globo ocular en el medio AIMS. Use pinzas rectas y tijeras de resorte finas para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.

Retire el cristalino con cuidado con dos pares de pinzas rectas y separe la retina de la esclerótica. Con unas tijeras de resorte finas, haga una incisión en la esclerótica hacia el nervio óptico y corte hasta que la retina se haya separado con éxito de la copa del ojo. Transfiera la pieza extirpada de la retina a la membrana de montaje con una pipeta de plástico de punta cortada.

A continuación, utilice un par de pinzas rectas para montar la retina de forma plana, asegurándose de que la capa de células ganglionares esté orientada hacia arriba. A continuación, utilice una pipeta de plástico equipada con una punta de pipeta de 100 microlitros para eliminar el medio, facilitando la adherencia de la pieza de retina a la membrana porosa. A continuación, voltee el conjunto sobre la guía de microelectrodos o MEA, colocando el GCL en la parte superior de los electrodos.

A continuación, llene el baño de muestras con medio oxigenado AIMS.