Coloque la retina de rata que expresa GCaMP 5G montada en el MEA con el GCL orientado hacia los electrodos en la platina del microscopio. Conecte el sistema de perfusión y ajuste los parámetros para perfundir constantemente el baño de muestras con el medio AMS oxigenado. A continuación, inspeccione la retina con un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lámpara fluorescente, un filtro FITC y una cámara CMOS.
Busque un área donde los electrodos estimulantes y la fluorescencia de las células que expresan GCaMP sean visibles. En el software de los dispositivos generadores de pulsos, configure los parámetros de estimulación eléctrica como la forma, la amplitud, la duración, el retardo de fase y la frecuencia de los pulsos para su aplicación. Conecte la cámara al generador de impulsos mediante la señal de disparo de salida y ajuste el modo de captura del software de la cámara en disparador de inicio externo.
Presione el botón de inicio en el software de la cámara para que espere un disparador externo para comenzar. Inicie el proceso de adquisición de imágenes utilizando el software generador de pulsos y guarde las imágenes capturadas, asegurándose de que el nombre del archivo incluya todos los parámetros de estimulación eléctrica aplicados. Ahora abra la imagen J y segmente la región de interés usando las herramientas de selección de área, agréguela al administrador de ROI y guárdela como una carpeta zip usando el menú del administrador de ROI.
Extraiga el valor medio de gris de los somas de celda navegando a más y haciendo clic en multicompase. Habilite las opciones de medir los 600 sectores y una fila por sector para obtener una única tabla en la que las columnas correspondan a los ROI y las filas correspondan a los períodos de tiempo. A continuación, extraiga el centroide de las ROI mediante el comando measure.
Para corregir el efecto de blanqueamiento fotográfico y minimizar el fondo, seleccione aproximadamente de 15 a 20 fotogramas de los intervalos no estimulantes antes de cada ráfaga y ajuste estos fotogramas a una curva lineal para garantizar un análisis óptimo de los datos. Se muestran los rastros de calcio de los somas celulares tras cinco ráfagas de trenes de pulsos cada 10 segundos durante una adquisición de imágenes de 60 segundos. Los fotogramas de los períodos no estimulantes se utilizan para corregir el efecto de fotodecoloración.
La relación entre la corriente requerida para activar las celdas y la distancia desde el electrodo estimulante mostró que las celdas ubicadas más cerca del electrodo estimulante requerían valores de corriente más bajos para evocar una respuesta.
