Para comenzar, coloque el ratón C57 Black/6 JRj anestesiado. Posición supina en una mesa de operaciones calentada. Confirme la ausencia de respuestas reflejas al pellizco de los dedos de los pies.
Rocíe el ratón con etanol al 70% para evitar que el pelo se pegue a las tijeras. Con unas tijeras, haga una incisión abdominal en la base, cortando hacia arriba en ambos lados de la caja torácica para exponer la cavidad abdominal. Use un hisopo de algodón para mover los intestinos hacia la derecha, exponiendo la vena porta.
Con pinzas curvas, coloque dos ligaduras debajo de la vena porta y ate sin apretar cada ligadura. A continuación, inserte un catéter de 0,7 milímetros en la vena porta. Cuando esté perforado, retire la aguja del catéter y guíe el catéter a través de la vena hasta que la punta del catéter esté cerca del hígado.
Luego, aprieta las ligaduras. Observa el hígado. Ajuste el caudal de la bomba de rodillos y conecte el tubo de profusión.
Iniciar la profusión del hígado a 37 grados centígrados. Una vez que el hígado se ponga pálido, use unas tijeras para cortar la caja torácica y el diafragma. Luego, con pinzas de punta fina, coloque la ligadura debajo de la vena cava inferior suprahepática.
A continuación, inserte un catéter en la vena cava inferior suprahepática a través de la aurícula derecha del corazón. Cuando esté perforado, retire la aguja y guíe el catéter a través de la vena más cercana al hígado. Luego, apriete la ligadura.
Coloque un tubo para la recolección del efluente de perfusión y asegure todos los tubos con cinta impermeable. Con un adaptador de pinza vascular, coloque una pinza vascular a través de la vena cava infrahepática inmediatamente por encima de la vena renal derecha para evitar la mezcla muerta. A continuación, aumente el caudal de perfusión a 3,5 mililitros por minuto.
Inicie el temporizador y el registro de presión. Cubra el hígado con un paño estéril humedecido con solución salina, equilibre durante 30 minutos y mida el volumen de efluente. Después de 30 minutos de equilibrio, inicie el experimento para la primera recolección de muestras de referencia en el colector de fracciones.
Controle la trampa de burbujas con regularidad y rellénela con tampón de perfusión cuando esté a punto de vaciarse. Recoger una muestra tampón a través de una llave de paso de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano y desde el catéter colector insertado en la vena cava inferior. Con un analizador de gases en sangre, mida la muestra recolectada para confirmar que el órgano está metabólicamente activo.
Después de 15 minutos de perfusión basal, utilizando una bomba de jeringa, iniciar la primera estimulación mediante la infusión de una sustancia problema a través de una llave de paso de tres vías al caudal deseado. Después de la simulación, recoja muestras de referencia durante 20 a 30 minutos antes de comenzar la segunda estimulación. La producción de urea en el hígado perfundido con períodos basales estables que preceden a cada uno de los dos períodos de estimulación sugiere que la respuesta de la urea a dos estimulaciones consecutivas con aminoácidos mixtos es consistente.
Se observó una liberación basal constante de glucosa y ácidos grasos no esterificados. Antes de un aumento robusto de glucosa y ácidos grasos no disfunción eréctil durante la infusión de glucagón. El valor medio en el estado basal y durante la infusión de glucagón sugiere que el glucagón estimula rápidamente la glucogenólisis hepática y la lipólisis.
Sin embargo, sin períodos basales estables, se hace imposible distinguir una respuesta de urea de la siguiente.
