Comience preparando el medio de cultivo endotelial completo utilizando 460 mililitros de medio de células endoteliales y agréguele 50 mililitros de FBS, cinco mililitros de penicilina estreptomicina y cinco mililitros de suplemento de crecimiento de células endoteliales. Los medios preparados se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante un mes. A continuación, en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros que contiene 0,1 millones de células vasculares a ocho mililitros del medio de cultivo endotelial completo preparado y se cultivan las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta alcanzar una cofluidez del 70%.
Luego, retire el medio de cultivo de la placa y enjuague las células dos veces con PBS para eliminar las células sueltas y los desechos. Después de retirar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina al 0,25%, que contiene 2,21 milimolares de EDTA a las células e incube la placa a 37 grados centígrados durante un minuto. Verifique el desprendimiento de células bajo un microscopio óptico con un aumento de 40 veces.
Neutralice la tripsina con siete mililitros de medio de cultivo endotelial completo y enjuague suavemente las células de la placa de cultivo. Centrifugar la suspensión celular después de recogerla en un tubo de 15 mililitros a 400 g durante 10 minutos. Vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio de cultivo endotelial completo después de eliminar el sobrenadante, luego cuente las células con un hemocitómetro y transfiera un volumen calculado de suspensión que contenga 2 millones de células a un tubo estéril de 1,5 mililitros.
Granular las células centrifugando la suspensión a 400 G durante cinco minutos antes de eliminar el sobrenadante. Las células vasculares ahora están listas para mezclarse con el gel de matriz para el ensayo de tapón de gel de matriz.
