Comience colocando un separador magnético en su soporte. Conecte una columna de selección al separador magnético y coloque un filtro de células de 70 micras en la parte superior de la columna de selección. Coloque un tubo de 50 mililitros debajo de la columna de selección para recoger el flujo.
Una vez que las células cerebrales del ratón alcancen el 80% de confluencia, aspire el medio y enjuague las células con PBS. Añadir 0,25% de tripsina para separar las células de adherencia e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue un búfer de detención.
Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante. Para la tinción de anticuerpos, resuspenda de 10 a las siete células en 100 microlitros de PBS. A continuación, agregue 10 microlitros de solución de anticuerpos LYVE-1 y mezcle bien.
Incubar la mezcla durante 30 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, centrifugar las células y desechar el sobrenadante. A continuación, enjuague las células añadiendo un mililitro de PBS y centrifugando a 300 G durante cinco minutos.
Para el etiquetado de microperlas, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de PBS y 20 microlitros de microperlas. Hacer hinchar e incubar durante 30 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar la suspensión y lavar el pellet con un mililitro de PBS.
Nuevamente, centrifugue y vuelva a suspender el gránulo en cuatro mililitros de PBS para la exclusión magnética negativa. Pasar la suspensión celular a través de un colador de 70 micras para eliminar grumos. Prepare la columna de selección enjuagándola con tres mililitros de PBS.
A continuación, agregue la suspensión de celdas en la columna de selección. Lave la columna con tres mililitros de PBS y recoja las células negativas de LYVE-1 en un tubo de 50 mililitros. Para la selección magnética positiva, pipetee seis mililitros de PBS en la columna de selección.
A continuación, enjuague las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna de selección para obtener LLEC positivos para LYVE-1. A continuación, centrifugar la suspensión celular positiva y eliminar el sobrenadante. Colocar de 10 a la quinta celda por centímetro cuadrado en un matraz T25 con cinco mililitros de medio de cultivo.
Mantenga el cultivo reemplazando el 50% del medio cada dos días. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, sepárelas como se demostró anteriormente antes de realizar el paso celular. El análisis de citometría de flujo reveló que el porcentaje de células positivas para LYVE-1 en el pasaje dos no fue significativamente diferente del paso tres después de MACS, lo que indica una pureza superior al 95%La tinción inmunofluorescente confirmó la co-tinción de LYVE-1 con PDPN, VEGFR-3 y PROX1, estableciendo la identidad de los LLECs.
Las células positivas para LYVE-1 no expresaron F48 ni el factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, lo que distingue eficazmente a los LLEC de los macrófagos y fibroblastos. Las células leptomeníngeas anteriores al MACS mostraban una morfología heterogénea que iba desde esferas redondas hasta formas de fibras fusionadas. Sin embargo, después de MACS, los LLEC exhibieron características típicas de tipo endotelial, como formas de huso y adoquines.
