Para empezar, incuba los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 grados centígrados. Ahora diseccione las pieles dorsales de los embriones de pollo de la etapa 30 a 33 en HBSS. A continuación, incubar las pieles en dos salinas libres de calcio y magnesio con 0,25% de EDTA durante 15 a 20 minutos.
Separe cuidadosamente el epitelio y el mesénquima con pinzas de relojero y mueva el material separado a HBSS, colocado en hielo. Recoja el mesénquima separado en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue dos mililitros de tripsina colagenasa al 0,1% hecha en PBS. A continuación, incuba la solución en un baño de agua.
A continuación, utilice una pipeta pasteur para dispersar el mesénquima de la piel en una suspensión unicelular. A continuación, añada ocho mililitros de DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino para detener la digestión. Centrifugar las células a 233 G durante cinco minutos.
A continuación, vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo. A continuación, coloque un inserto de cultivo celular en un pocillo de un plato de seis pocillos, deje caer una gota de 10 microlitros de las células mesenquimales sobre el inserto. En el pocillo exterior del inserto, pipetee dos mililitros de DMEM con un 10% de suero bovino fetal.
Incubar las celdas plateadas a 37 grados en un juego de incubadora con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante una hora. Con una pipeta de un mililitro, transfiera el epitelio intacto sobre la gota mesenquimal plateada. Aplanar el epitelio intacto sobre el mesénquima para formar el explante de piel reconstituido.
Deje una capa delgada de medio en el inserto para mantener la piel del explante semi húmeda. Proporcionando una interfaz aire/líquido, incube el explante de piel reconstituida a 37 grados en una incubadora con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de aire ambiente. Los cultivos de órganos ex vivo parecen homogéneos al principio: yemas de plumas cortas formadas después de dos a tres días en cultivo, y yemas de plumas largas formadas después de cuatro a cinco días en cultivo.
