Comience transfiriendo la suspensión de células tumorales pancreáticas previamente descongeladas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y agregue PBS para alcanzar un volumen final de dos mililitros. Luego, use un hemocitómetro para evaluar la cantidad y calidad de las células. Una vez obtenido el gránulo celular mediante centrifugación, utilizando puntas de pipeta progresivamente más pequeñas, decantar cuidadosamente el sobrenadante para minimizar la distribución del gránulo y maximizar el fluido decantado.
Prepare 1X tampón de lisis celular, luego agregue 100 microlitros a 900 microlitros de tampón de dilución de lisis celular previamente preparado para obtener 0.1X de tampón de lisis celular. Transfiera 100 microlitros de tampón de lisis celular 0.1X refrigerado al gránulo celular y pipetee suavemente cinco veces para garantizar una resuspensión completa. Después de la incubación en hielo durante tres minutos, agregue un mililitro de tampón de lavado frío al gránulo resuspendido y pipetee suavemente cinco veces.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante como se muestra y repita este proceso de lavado dos veces más. Cargue la suspensión teñida con azul de tripano en un hemocitómetro para contar el número de núcleos. Vuelva a suspender el gránulo de núcleos en un tampón de núcleos 1X en función de la recuperación de núcleos objetivo objetivo.
Pase con cuidado los núcleos resuspendidos a través de un colador de células con punta de pipeta de 40 micrómetros y luego manténgalo en hielo. Ahora relata los núcleos. Los núcleos obtenidos con este método exhibieron un tamaño y forma adecuados.
Se puede observar un leve punteado ocasional de la envoltura nuclear que debe ser monitoreado en la evaluación nuclear final a través de un hemocitómetro.
