Comience por incrustar el tejido pulmonar y la agarosa y seccionarlo con un vibrátomo. A los pañuelos de papel cortados, agregue 300 microlitros del agente bloqueador. Incubar la placa a cuatro grados centígrados en una coctelera con agitación suave durante 45 minutos.
A continuación, pipetee 300 microlitros del anticuerpo primario diluido PBS en cada pocillo. Incubar la placa durante la noche a cuatro grados centígrados agitando suavemente. Ahora pipetee suavemente los anticuerpos primarios sin tocar la rebanada.
Lave las rodajas tres veces con 400 microlitros de PBS. A continuación, pipetee 300 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos en cada pocillo. Retire la solución de anticuerpos después de la incubación en frío durante 90 minutos.
A continuación, añada el DAPI y la lectina de tomate 488 a los pocillos. Incuba la mezcla durante 30 minutos. Después de eliminar el DAPI y la lectina de tomate, lave las rodajas en PBS durante tres ciclos de 10 minutos.
Con un cepillo, transfiera las rodajas a un portaobjetos. Coloque tres gotas de medio de montaje en el portaobjetos y monte un cubreobjetos sobre él antes de tomar imágenes. Las secciones pulmonares de las muestras de ratón, cerdo y humano se tiñeron con inmunofluorescencia para AME, elastina y LEA.
Se observó que la AME y la elastina se distribuyen a través de estructuras como conductos alveolares, vasos sanguíneos, bronquiolos y alvéolos. Se realizó una comparación de la distribución de neumocitos tipo II en humanos adultos y lactantes. El anticuerpo de células alveolares tipo II HT2-280 tuvo una fuerte afinidad con la superficie celular de los neumocitos.
La muestra infantil arrojó un recuento significativamente mayor de neumocitos tipo II. Sin embargo, la muestra de bebés también exhibió una cobertura de andamios significativamente mayor que la del adulto. El número de neumocitos tipo II basado en la cobertura del andamio también fue significativamente mayor en los lactantes.
