Comience cultivando las muestras de ojales aisladas de ratones de dieta regular en grasas o en ratones de dieta alta en grasas durante la noche a 37 grados centígrados. Diseñar las condiciones experimentales deseadas para el estudio. Para cada condición experimental, usando una pipeta, recoja 100 ollaos en una placa de Petri de seis centímetros que contenga dos mililitros de medio para ojales.
Para inducir la mitofagia, trate los ojales en las placas de Petri apropiadas con dos microlitros de 250 nanomolares de valinomicina durante tres horas. Aísle los ojales y, con una pipeta, transfiera los ojales de cada placa de Petri a un tubo de microcentrífuga separado. A continuación, gire los ojales a 350 G durante un minuto a 10 grados centígrados y, con una pipeta, deseche el sobrenadante.
Lavar la muestra obtenida dos veces con un mililitro de PBS. Entre los lavados, centrifugar la muestra y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Para disociar los ojales en células individuales, agregue 500 microlitros de tripsina al 0,05% precalentada a 37 grados centígrados, a un tubo de muestra.
Pipetear el contenido del tubo hacia arriba y hacia abajo repetidamente hasta que los ojales estén visiblemente dispersos. Agregue inmediatamente un mililitro de medio de ojal precalentado para neutralizar la tripsina. Centrifugar las muestras a 500 G durante cinco minutos a 10 grados centígrados.
Retire el sobrenadante con cuidado sin alterar el gránulo. A continuación, lave las muestras dos veces con medio de flujo de ojales. Las muestras celulares ya están listas para ser teñidas para el análisis citométrico de flujo de la mitofagia de células beta.
