E.L-D. NIH'den (T32-AI007413 ve T32-AG000114) destek alır. SAS, JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Gazi İşleri Bakanlığı (I01 BX004444), Brehm ailesi ve Anthony ailesi.

Bu protokolde sunulan hayvan çalışmaları, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için 15 haftalık düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD) kullanan yirmi haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.
1. Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 1)
<ol><li>Fare adacığı hazırlama ve tedavi<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.<ol><li>Daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD,% 60 kcal%Yağ 19) farelerinden adacıkları izole edin 2,10.</li>
			<li>100 ünite/mL antimikotik-antibiyotik, 50 ünite/mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş RPMI ortamında gece boyunca 37 °C'de kültür adacık örnekleri (bkz. Bu ortam "adacık ortamı" olarak anılacaktır.</li>
			<li>Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamında 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin. NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: boyanmamış RFD adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış RFD adacıkları; (4) Sadece MtFaji kontrolü: MtFaji ile boyanmış RFD adacıkları; (5) Sadece TMRE kontrolü: TMRE ile boyanmış RFD adacıkları; (6) RFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (7) Valinomisine maruz kalan RFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (8) HFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları; (9) Valinomisine maruz kalan HFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları.</li>
			<li>Valinomisin'e maruz kalan (7) ve (9) koşullar için (yukarıdaki NOT'a bakınız), mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nΜ valinomisin stoğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
		</ol></li>
		<li>Tek hücre ayrışması gerçekleştirin.<ol><li>3 saat valinomisin maruziyetinden sonra, bir pipet kullanarak her koşuldan 100 adacığı ayrı mikrosantrifüj tüplerine seçin.</li>
			<li>Adacıkları 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da döndürün ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.</li>
			<li>Numuneleri 2 kez 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile, her yıkama arasında sıkma adımlarıyla (350 x g / 1 dk, 10 ° C) yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.</li>
			<li>Adacıkları tek hücrelere ayırmak için, adacıkların aşırı sindirimini önlemek için bir numunenin mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.05 tripsin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin. Adacıklar gözle görülür şekilde dağılana kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
			<li>Tripsini nötralize etmek için hemen 1 mL önceden ısıtılmış adacık ortamı ekleyin. Her numune için tripsinizasyon ve nötralizasyonu teker teker tekrarlayın.</li>
			<li>Numuneleri 500 x g'da 10 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. NOT: Valinomisin'e maruz kalan numuneler için pelet hassas olacaktır.</li>
			<li>Numuneleri 2x RPMI ortamıyla, fenol kırmızısı olmadan, 100 birim / mL antimikotik-antibiyotik, 50 birim / mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve% 10 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş yıkayın. Bu ortam "adacık akış ortamı" olarak anılacaktır. Her yıkama arasında sıkma adımlarını (350 x g/1 dk, 10 °C) ekleyin. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Akış sitometrisine hazırlanmak için hücreleri MtFagy, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.<ol><li>Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>MtPhagy boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM MtFaji stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (koşullar 4, 6, 7, 8 ve 9, adım 1.1.1'e NOT).</li>
			<li>TMRE boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM TMRE stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (koşullar 5, 6, 7, 8 ve 9).</li>
			<li>Fluozin-3-boyası alan tüplere (koşullar 3, 6, 7, 8 ve 9) 0.25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
			<li>Vorteks tüpleri 5 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.</li>
			<li>Işıktan korumak için mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun yarısında, vorteks tüplerini 5-10 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.</li>
			<li>İnkübasyondan sonra, numuneleri 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın.</li>
			<li>Numuneleri 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. 2, 6, 7, 8 ve 9 koşullarına 0,2 μg/mL DAPI (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
			<li>Numuneleri 350 x g'da 10 °C'de 1 dakika döndürün. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi<ol><li>Cihazı başlatın (Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) MtFagy boyası için BL2: Uyarma/Emisyon - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) TMRE için YL1: Uyarma/Emisyon - 561 nm/585 nm (16 nm).</li>
		<li>Hücre popülasyonlarının dağılım grafiğinin merkezinde olduğundan emin olmak için ileri (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını ayarlayın. Bu protokol için kullanılan voltajlar, hücrelerin FSC-A vs. içinde eşit şekilde düşmesini sağlamak için FSC için 120 V ve SSC için 260 V idi. SSC-A grafiği (Şekil 1A).</li>
		<li>Tek olmayan hücreleri hariç tutmak için, FSC-H vs. FSC-W ve ardından SSC-H vs. SSC-W (Şekil 1B,C).</li>
		<li>Canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI'nin voltajlarını ve kompanzasyonunu ayarlayın. Boyanmamış RFD örneğine dayalı olarak kullanılan her florofor için floresan kapıları ayarlayın (Şekil 1D-F). NOT: Her kanal için kullanılan voltajlar: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.</li>
		<li>Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. NOT: Bu geçit yaklaşımı kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal koşullar altında ve valinomisin indüksiyonu üzerine mitofaji seviyeleri değerlendirildi (Şekil 2).</li>
		<li>Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 2)
<ol><li>Fare adacık hazırlığı ve tek hücreli ayrışma<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.<ol><li>Pankreas adacıklarını vahşi tip (WT) ve mt-Keima/+ (mt-Keima) farelerinden izole edin6. Bu yöntemde 20 haftalık erkek WT veya mt-Keima/+ ile beslenen RFD fareler kullanıldı.</li>
			<li>Kültür adacık örnekleri, adacık ortamında 37 °C'de gece boyunca alınır.</li>
			<li>Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamı olan 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin. NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: Boyanmamış WT adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış WT adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış WT adacıkları; (4) mt-Keima sadece kontrol: Boyanmamış mt-Keima/+ adacıkları; (5) Tedavi edilmemiş: Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış mt-Keima/+ adacıkları; (6) Valinomisin: mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan ve Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış adacıklar.</li>
			<li>Valinomisin maruziyeti olan durum (6) için, mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nM valinomisin stoğu ekleyin.</li>
		</ol></li>
		<li>Tek hücreli ayrışma gerçekleştirin.<ol><li>Adım 1.1.2'de açıklandığı gibi tek hücreli ayrışma adımlarını gerçekleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücreleri Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.<ol><li>Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>Fluozin-3-boyası alan tüplere 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ekleyin (koşullar 3, 5 ve 6).</li>
			<li>Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve 1.1.3.5-1.3.10 adımlarında açıklandığı gibi DAPI tedavisine devam edin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi<ol><li>Enstrümanı başlatın. Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. NOT: Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) mt-Keima nötr için VL3: Uyarma/Emisyon - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) mt-Keima asidi için YL2: Uyarma / Emisyon - 561 nm / 620 nm (15 nm).</li>
		<li>FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın ve 1.2.2-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi tek olmayan hücreleri hariç tutun (Şekil 3A-C).</li>
		<li>Floresan pozitif hücre popülasyonlarının boyanmamış hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için boyanmamış ve tek pozitif kontroller (koşullar 1-4) kullanarak DAPI, Fluozin-3-ve mt-Keima için voltajları ve kompanzasyonları ayarlayın. Her kanala uygun kompanzasyon uygulandıktan sonra, canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI negatif kapısı ve Fluozin-3-pozitif kapıları ayarlayın (Şekil 3D-E).</li>
		<li>Asidik ve nötr hücre popülasyonlarını tanımlamak için mt-Keima pozitif örneğini (koşul 4) kullanarak bir üçgen geçit şeması oluşturun (Şekil 3F). NOT: CilttagHer kanal için tipik olarak kullanılır: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.</li>
		<li>Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. Koşullar 5 ve 6 için geçit şemaları Şekil 3A-G'de gösterilmiştir.</li>
		<li>Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Murin Pankreatik β-Hücrelerinde Mitofajinin Kantitatif Analizi

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

SAS, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.'den hibe fonu almıştır ve Novo Nordisk'in danışmanıdır.

Bu protokol, ayrışmış primer fare adacıklarında mitofaji akısını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemi tanımladı. Mt-Keima yöntemi kullanılarak, mitofajideki bir artış, asidik (561 nm) / nötr (405 nm) hücrelerin oranının artması olarak ölçülürken, MtFaji yönteminde, artan mitofaji akısı, FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücre popülasyonunda bir artış olarak ölçüldü. Bu yöntemler, mitofaji akısının hızlı, kantitatif ve β hücreye özgü ...

Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütlerezervine bağlı olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir 1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir4. Mitofaji olarak da bilinen seçici mitokondriyal otofaji, mitokondriyal kalite kontrol yolunun önemli bir bileşenidir.
Canlı hücrelerde mitofaji değerlendirmeleri genellikle mitofaji sırasında meydana gelen mitokondriyal pH'daki değişikliklere dayanır. Mitokondri hafif alkali bir pH'a sahiptir ve sağlıklı mitokondri normalde pH-nötr sitozolde bulunur. Mitofaji sırasında, hasarlı veya işlevsiz mitokondri seçici olarak otofagozomlara dahil edilir ve sonunda asidik lizozomlar5 içinde temizlenir. mt-Keima6, mitoQC7 ve CMMR8 gibi birkaç in vivo transgenik mitofaji raportör fare modelinin yanı sıra Cox8-EGFP-mCherry plazmid9 gibi transfekte edilebilir mitofaji probları, mitofajinin kantitatif değerlendirmelerini sağlamak için bu pH değişimini kullanır. mt-Keima pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu eksprese eden transgenik farelerin kullanımı, akış sitometrisi10,11 yoluyla adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji değerlendirmeleri için optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı (asidik 561 nm'nin nötr 480 nm uyarıma oranı) mitofajiyi 6,12 sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.
Bu protokol, mt-Keima transgenik farelerinden izole edilen primer adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklar10,11. mt-Keima oldukça hassas bir prob olsa da, ya karmaşık hayvan yetiştirme şemaları ya da hücrelerin transfeksiyonunu gerektirir, bu da diğer genetik modellerle veya birincil insan adacıklarıyla birlikte çalışırken genellikle zor olabilir. Ek olarak, nötr ve asidik hücre popülasyonlarını tanımlamak için çoklu floresan lazerlerin ve dedektörlerin kullanılması, diğer floresan raportörlerin kombinatoryal kullanımını sınırlayabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol aynı zamanda izole fare adacıklarından β hücrelerinde mitofajinin sağlam tespiti için tamamlayıcı, tek floresan kanallı, boya bazlı bir yöntemi de açıklar. MtFagy yöntemi olarak adlandırılan bu yaklaşım, β hücrelerini seçmek, aktif olarak mitofaji geçiren hücre popülasyonlarını ölçmek ve aynı anda mitokondriyal membran potansiyelini (MMP veya Δψm) değerlendirmek için üç hücre geçirgen boyanın bir kombinasyonunu kullanır.
Bu boyalardan ilki, Ex/Em 494/516 nm13'e sahip hücre geçirgen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-'dir. Fare adacıkları, α, β, δ- ve PP hücreleri dahil olmak üzere işlevsel olarak farklı hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon içerir. β-Hücreleri, fare adacığı içindeki hücrelerin yaklaşık% 80'ini oluşturur ve insülin granülleri14,15 içindeki yüksek Zn2+ konsantrasyonları nedeniyle diğer adacık hücre tiplerinden ayırt edilebilir, bu da β hücrelerinin Fluozin-3-yüksek popülasyonu olarak tanımlanmasına izin verir. Kimyasal bir bağ yoluyla mitokondri üzerinde hareketsiz hale getirilen ve zayıf floresan yayan pH'a duyarlı bir boya olan MtPhagy boyası da bu protokoldekullanılmaktadır 16. Mitofaji indüksiyonu üzerine, hasarlı mitokondri asidik lizozoma dahil edilir ve MtFagy boyası, düşük pH ortamında (Ex/Em 561/570-700 nm) floresan yoğunluğunu arttırır.
Ek olarak, MMP'yi değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) kullanılır. TMRE, membran potansiyeli 17 tarafından desteklenen nispi negatif yük nedeniyle sağlıklı mitokondri tarafından tutulan, hücre geçirgen pozitif yüklü bir boyadır (Ex/Em552/575 nm). Hasarlı veya sağlıksız mitokondri, membran potansiyellerini dağıtır ve bu da TMRE'yi ayırma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu boyalar birlikte kullanıldığında, mitofajiye uğrayan β hücreleri, akış sitometrisi yoluyla FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlanabilir. Mitofaji statik bir süreçten ziyade dinamik bir süreç olduğundan, bu protokol, MMP18'in dağılmasını takiben mitofajiyi indükleyen bir K+-iyonofor olan valinomisin kullanılarak mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Valinomisin varlığında ve yokluğunda mitofajinin karşılaştırılması, farklı örneklem gruplarında mitofaji akısının değerlendirilmesine olanak tanır.
Mevcut yaklaşımın boya bazlı doğası, insan adacıklarına ve diğer transfekte edilmesi zor hücre tiplerine tahmin edilmesine izin verir ve mt-Keima protokolünün aksine karmaşık hayvan yetiştirme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu protokolün genel amacı, iki bağımsız akış sitometrisi tabanlı yöntemle tek hücre düzeyinde β hücrelerde mitofajiyi ölçmektir. Birlikte ele alındığında, bu protokol, mitokondriyal kalite kontrolünün kantitatif çalışmasında hem kesinlik hem de esneklik sağlayan iki güçlü ve tamamlayıcı yöntemi açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

Mitofaji, optimal mitokondriyal fonksiyonu sürdürmek için gerekli bir kalite kontrol mekanizmasıdır. Disfonksiyonel β hücreli mitofaji, yetersiz insülin salınımına neden olur. Mitofajinin gelişmiş kantitatif değerlendirmeleri genellikle genetik raportörlerin kullanılmasını gerektirir. Akış sitometrisi yoluyla mitofajiyi ölçmek için mitokondri hedefli pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu ifade eden mt-Keima fare modeli, β hücrelerde optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı, mitofajiyi sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık genetik fare modelleri veya birincil insan adacıkları gibi transfekte edilmesi zor hücrelerle çalışırken genetik mitofaji raportörlerini kullanmak zor olabilir. Bu protokol, MtFagy kullanarak birincil adacıklarda β hücreli mitofajiyi ölçmek için yeni bir tamamlayıcı boya bazlı yöntemi açıklar. MtFagy, mitokondride biriken ve mitofaji sırasında lizozomlar gibi mitokondri düşük pH'lı ortamlarda olduğunda floresan yoğunluğunu artıran, pH'a duyarlı, hücre geçirgen bir boyadır. MtFagy boyasını, β hücrelerini seçen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-ve mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) ile birleştirerek, mitofaji akısı, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerde spesifik olarak ölçülebilir. Bu iki yaklaşım oldukça tamamlayıcıdır ve çok sayıda β hücreli modelde mitokondriyal kalite kontrolünün değerlendirilmesinde esneklik ve kesinlik sağlar.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

Yazar Spotlight: Pankreas β hücrelerinde mitofaji akısının etkili ve sağlam tamamlayıcı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilmesi 

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi Bu boya bazlı yaklaşım, ölü hücreleri dışlamak için DAPI'nin yanı sıra Fluozin-3-, TMRE ve MtPhagy kullanılarak, genetik bir raportöre ihtiyaç duymadan birincil fare β hücrelerindeki mitofaji akışını analiz etmek için optimize edilmiştir. Bu protokol, mitofajiyi indüklemek için bu boyaları valinomisin ile eşleştirerek, birincil fare β hücrelerinde mitofaji akısını seçici olarak ölçmek için boya bazl?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Protokolümüz, akış sitometrisi yoluyla tek hücre çözünürlüğünde beta hücre mitofaji akısını incelemek için iki tamamlayıcı yöntemi açıklar. mt-Keima protokolü genetik bir mitofaji raportörü kullanırken, MtPhagy protokolü üç floresan boyayı birleştirir, bu da insan örneklerinde transfekte edilmesi zor hücrelere ekstrapolasyon yapmayı kolaylaştırır. Geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar ve görüntüleme yaklaşımları kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi hem zaman alıcı hem de zordur.Bu nedenle, beta hücrelerinde mitofaji akısını incelemek için yeni, sağlam ve etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Hem mt-Keima hem de MtPhagy yöntemi, pankreas beta hücrelerinde mitofaji akısını incelemek için etkili olan kantitatif değerlendirmelerdir. Bu nedenle, Soleimanpour laboratuvarı pankreas beta hücre yetmezliği ve diyabeti yönlendiren farklı mekanizmalara odaklanmaktadır.Ve özellikle mitokondriyal fonksiyondaki kusurların diyabet gelişimini nasıl yönlendirdiğini anlamak için mitofaji de dahil olmak üzere mitokondriyal yaşam döngüsünün farklı yönlerine odaklanıyoruz.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

685 Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Protokolümüz, akış sitometrisi yoluyla tek hücre çözünürlüğünde beta hücre mitofaji akısını incelemek için iki tamamlayıcı yöntemi açıklar. mt-Keima protokolü genetik bir mitofaji raportörü kullanırken, MtPhagy protokolü üç floresan boyayı birleştirir, bu da insan örneklerinde transfekte edilmesi zor hücrelere ekstrapolasyon yapmayı kolaylaştırır. Geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar ve görüntüleme yaklaşımları kullanılarak mitofajinin değerlendir...