Para empezar, tome un ratón anestesiado y aplique una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% en el ojo para dilatar la pupila. A continuación, aplique un gel oftálmico en la córnea para evitar la sequedad y las cataratas inducidas por la anestesia. A continuación, coloque un microscopio quirúrgico vertical con una trayectoria de luz directa en un entorno estéril para realizar la inyección subretiniana.
Para preparar la jeringa de vidrio de 10 microlitros, separe el cubo de la aguja y coloque la aguja roma de calibre 33. Tome la cubierta metálica del cubo y sujete firmemente la aguja a la jeringa. Enjuague la aguja con agua destilada para probar la fuga y la permeabilidad de la aguja.
A continuación, vacíe la jeringa y déjela a un lado con cuidado. A continuación, coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla y oriente el ojo de tratamiento hacia el objetivo del microscopio. Aplique clorhidrato de proparacaína al 0,5% y espere 30 segundos.
A continuación, aplique 150 microlitros de gel oftálmico en el ojo y coloque un cubreobjetos redondo. Realice un examen ocular preliminar observando la córnea, el iris, la pupila, el cristalino y la conjuntiva. Ajuste el plano focal para visualizar el fondo del ojo del ratón a través de la pupila.
A continuación, alinee la cabeza de modo que la cabeza óptica se alinee con el centro de la pupila. A continuación, golpee la base del tubo que contiene los progenitores fotorreceptores derivados de HESC para obtener una suspensión celular uniforme. Usando una jeringa de microlitros de vidrio de 10 microlitros con una aguja roma de calibre 33, extraiga dos microlitros de mezcla celular.
Use una aguja desechable de calibre 30 para crear una herida de esclerectomía colocada dos milímetros detrás del limbo. Mantenga el ángulo de la aguja a aproximadamente 45 grados para evitar el contacto con la lente. Una vez que la punta de la aguja se haga visible dentro del ojo, retraiga la aguja con cuidado.
Deseche la aguja usada en un recipiente afilado para evitar lesiones por pinchazos con la aguja. Ahora tome la jeringa de vidrio e inserte la aguja roma en la herida de la esclerectomía. Avance la aguja roma sin tocar el cristalino hasta que llegue a la retina opuesta de la herida de entrada.
Penetre suavemente en la retina hasta que se vea una rama de presión en la esclerótica. A continuación, inyecte dos microlitros de la suspensión celular o del medio PRDM en el espacio subretiniano mientras se mantiene una presión suave sobre la jeringa. La formación de una ampolla visible indica una inyección exitosa.
Espere 10 segundos para permitir que las células se asienten. Retraiga suavemente la aguja del ojo. Para visualizar la ampolla, mueva la cabeza del ratón para colocar el ojo bajo el microscopio y asegure la posición sujetando suavemente la cabeza.
Para la OCT intraoperatoria, utilice la función IOCT en el microscopio quirúrgico y seleccione el cubo en la pantalla de OCT. Coloque el área de escaneo en la ampolla presionando los botones de flecha. Para ajustar la OCT, el centrado de la diapositiva y el enfoque para obtener la mejor calidad de OCT, presione capturar o escanear para adquirir el escaneo OCT del área de la ampolla y revise las imágenes para verificar la calidad de los escaneos.
Por último, retira el cubreobjetos y limpia suavemente el gel del ojo con una gasa. Administre la pomada antibiótica una vez después de la inyección para prevenir infecciones. La tomografía computarizada reveló distintas entidades HESC suspendidas en el ojo tratado con células.
Por el contrario, el ojo tratado con medios mostraba líquido no nublado, vacío de células dentro del espacio subretiniano.
