Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee y Yingying Chung por brindar asistencia técnica para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC del día 32 después de la criopreservación. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Premio de Beca de Investigación para Jóvenes Investigadores del Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC/OFYIRG/0042/2017) y la24ª Subvención del Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación (CRP24-2020-0083) a H.G.T.

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).
1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación
<ol><li>Medio de diferenciación fotorreceptor precalentado (PRDM) en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Recuperar un criovial que contiene células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC de día 32 a partir de nitrógeno líquido. Manténgalo en hielo seco.</li>
	<li>Descongelar la criovial a 37 °C al baño maría durante 3-5 min. Resuspender las 32 células del día en 1 mL de PRDM y centrifugar a 130 x g durante 4 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de PRDM.</li>
	<li>Retire 10 μL de la mezcla para el recuento de células. Mezcle las células con azul de tripano al 0,2% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetee la mezcla de células en el portaobjetos de la cámara de recuento de células. Determine el número de celdas y la viabilidad mediante un contador de celdas automatizado.</li>
	<li>Continúe con el siguiente paso cuando la viabilidad de la célula sea superior al 70%. Centrifugar la suspensión celular restante a 130 x g durante 4 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en PRDM a la concentración de 3 x 105 células/μL para trasplante.</li>
	<li>Observe si hay grupos celulares visibles. Vuelva a suspender los grupos celulares repetidamente utilizando una punta de pipeta de 10 μL en el tubo de microfuga hasta que no se observe ningún grupo celular visible. Cargue en la jeringa de inyección 33G para observar la extrusión de la solución celular a través de la aguja.</li>
</ol>2. Liberación sub-retiniana de las hESCs en ratones rd10
<ol><li>Preparación de los animales<ol><li>Anestesiar al ratón (P20, macho/hembra, 3-6 g) utilizando una combinación de ketamina (20 mg/kg de peso corporal) y xilacina (2 mg/kg de peso corporal) en una jeringa de tuberculina de 1 ml unida a una aguja de 27G por vía intraperitoneal. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) al ratón como analgésico preventivo.</li>
		<li>Después de administrar la anestesia, instilar una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% para la dilatación de la pupila. Aplique un gel oftálmico en la córnea para evitar que el ojo se seque y las cataratas relacionadas con la anestesia.</li>
		<li>Coloque al ratón en una jaula vacía hasta que esté completamente anestesiado. Evalúe el nivel adecuado de anestesia pellizcando la almohadilla de la pata y confirme si el animal no reacciona al pellizco fuerte.</li>
		<li>Cuando el ratón esté completamente anestesiado, coloque al animal sobre una almohadilla tibia colocada a 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Liberación sub-retiniana de las células<ol><li>Para utilizar un abordaje de pars plana transvítrea de 1 puerto, como se hace aquí, realice la inyección subretiniana en un entorno estéril. Utilice un microscopio de operación vertical con una trayectoria de luz directa para realizar la inyección.</li>
		<li>Prepare la jeringa de vidrio de 10 μL retirando el cubo de la aguja. Monte la aguja roma 33G en la jeringa de vidrio. Tome la cubierta metálica del cubo y asegure con cuidado la aguja en la jeringa.</li>
		<li>Enjuague con agua destilada para verificar si hay signos de fugas y permeabilidad de la aguja. Vacíe la jeringa y colóquela a un lado con cuidado.</li>
		<li>Coloque el ratón anestesiado sobre una almohada, con el ojo de tratamiento mirando hacia arriba directamente hacia el objetivo del microscopio. Aplicar el clorhidrato de proparacaína al 0,5% y esperar 30 s. Aplicar 150 μL de gel oftálmico sobre el ojo y colocar sobre él un cubreobjetos redondo.</li>
		<li>Realice un examen aproximado del ojo observando la córnea, el iris, la pupila, el cristalino y la conjuntiva. A través de la pupila, visualiza el fondo del ojo del ratón ajustando el plano focal. Ajuste la cabeza hasta que la cabeza óptica se coloque en el centro de la pupila y minimice el movimiento de la cabeza colocándola correctamente sobre la almohada.</li>
		<li>Golpee suavemente la base del tubo con las hESC varias veces para obtener una suspensión celular uniforme. Utilizando la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL con una aguja roma de 33G, extraiga 2 μL de células/medios. Extraiga las células justo antes de la inyección para evitar que las células se asienten o se aglutinen en la jeringa.</li>
		<li>Con una aguja desechable de 30 G, haga una herida de esclerectomía a 2 mm detrás del limbo. Mantenga el ángulo de la aguja a ~45° para evitar tocar la lente. Una vez que se visualice la punta de la aguja en el ojo, retire suavemente la aguja. Deseche la aguja en el recipiente afilado después de usarla para evitar lesiones por pinchazos con la aguja.</li>
		<li>Tome la jeringa de vidrio e inserte la aguja roma en la herida de la esclerectomía. Sin tocar el cristalino, avance la aguja roma hasta que llegue a la retina opuesta de la herida de entrada. Asegúrese de que el área de la inyección esté libre de los principales vasos sanguíneos de la retina para evitar sangrado.</li>
		<li>Penetre suavemente en la retina hasta que se vea una rama de presión en la esclerótica. Mantenga el extremo romo de la aguja paralelo a la esclerótica para evitar la fuga de las células hacia el espacio vítreo.</li>
		<li>Inyecte lentamente 2 μL de suspensión celular o medio PRDM (control) en el espacio subretiniano mientras se mantiene una presión suave sobre la jeringa. Con una inyección exitosa, se debe formar una ampolla visible (es decir, una retina elevada con la suspensión/medio celular en ella) en el lugar de la inyección. NOTA: Solo se debe usar una presión suave durante la inyección para evitar el desgarro de la retina y el bloqueo de las células en la punta de la aguja.</li>
		<li>Después de confirmar la ampolla, espere 10 segundos para que las células se asienten. Retraiga suavemente la aguja del ojo.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografía de coherencia óptica (OCT) intraoperatoria de la ampolla (opcional)<ol><li>Coloque el ojo del ratón para visualizar la ampolla bajo el microscopio moviendo lentamente la cabeza. Asegure la posición sujetando suavemente la cabeza. No es necesaria una dilatación adicional de la pupila. No retire el cubreobjetos y el gel del ojo. Proporciona un medio óptico claro para visualizar la ampolla.</li>
		<li>Realice la OCT intraoperatoria utilizando la función iOCT incorporada del microscopio quirúrgico.</li>
		<li>Presione la opción Cubo en la pantalla OCT y coloque el área de escaneo en la ampolla presionando los botones de flecha . Ajuste la OCT deslizando el centrado y el enfoque para obtener la mejor calidad de OCT. Presione Capturar/Escanear para adquirir el escaneo OCT del área de la ampolla. Revise las imágenes para comprobar la calidad de los escaneos.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperación<ol><li>Retire el cubreobjetos y limpie el gel del ojo con una gasa. Aplique ungüento antibiótico una vez después de la inyección para prevenir infecciones.</li>
		<li>Permita que el animal se recupere de la anestesia bajo una luz cálida hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regresar a la jaula de origen. Vigile al animal durante al menos 3 días después de la inyección para detectar signos de inflamación, infección y angustia. NOTA: La luz cálida de 150 W debe estar al menos a 30 cm de distancia de la jaula del animal, y se debe tener precaución para evitar una lesión por quemadura.</li>
		<li>Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 horas durante 1 día o según recomendación del veterinario. Si se observa inflamación o infección del ojo, consulte a un profesional veterinario para el tratamiento adecuado.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpieza y esterilización del instrumental<ol><li>Enjuague la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL y la aguja roma de 33G con etanol al 100% 10x. Lave el etanol flasheando la jeringa con agua destilada.</li>
		<li>Desmonte la jeringa de vidrio y la aguja. Seque la jeringa para guardarla.</li>
	</ol></li>
</ol>

Revitalización de la vista: terapia con células madre para la degeneración de la retina

Hwee Goon Tay es cofundador de Alder Therapeutics AB. Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.

La inyección subretiniana se ha utilizado para el trasplante en suspensión celular para tratar el EPR y las enfermedades de la retina 23,25,26,27,28,31,40. Este enfoque es muy esencial en los estudios con roedores, no solo para el trasplante de células y los enfoques de terapia génica, s...

Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)1. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre embrionarias (ESC)2,3,4, células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células madre y células progenitoras de la retina (RPC)4,5,6,7,8 para restaurar las células fotorreceptoras dañadas. El espacio sub-retiniano, un espacio confinado entre la retina y el EPR, es un lugar atractivo para depositar estas células para reemplazar las células fotorreceptoras dañadas, el EPR y las células de Mueller debido a su proximidad 9,10,11.
Las terapias génicas y celulares han estado utilizando el espacio sub-retiniano para la medicina regenerativa para diversas enfermedades de la retina en estudios preclínicos. Esto incluye la administración de copias funcionales del gen o de las herramientas de edición génica en forma de terapia con oligonucleótidos antisentido12,13 o CRISPR/Cas9 o la edición de bases a través de una estrategia basada en virus adenoasociados (AAV) 14,15,16, la implantación de materiales (p. ej., lámina de EPR, prótesis retinianas 17,18,19) y organoides retinianos diferenciados derivados de células madre 20,21,22 para tratar enfermedades relacionadas con la retina y el EPR. Ensayos clínicos que utilizan hESC-RPE31 en el espacio subretiniano para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) asociada a RPE6523,24, la acromatopsia ligada a CNGA325, la retinosis pigmentaria asociada a MERTK26, la coroideremia 27,28,29,30 han demostrado ser un enfoque eficaz. La inyección directa de células en las proximidades del área dañada mejora en gran medida la posibilidad de asentamiento celular en la región apropiada, la integración sináptica y la eventual mejoría visual.
A pesar de que se ha establecido la inyección sub-retiniana en modelos humanos y de ojos grandes (es decir, cerdo 32,33,34,35, conejo 36,37,38,39,40 y primates no humanos 41,42,43), dicha inyección en el modelo murino sigue siendo un desafío debido a la limitación del tamaño del globo ocular y al enorme tamaño del globo ocular. lente que ocupa el ojo del ratón 44,45,46. Sin embargo, los modelos modificados genéticamente solo están disponibles en animales pequeños y no en animales grandes (es decir, conejos y primates no humanos), por lo que la inyección subrretiniana en ratones llama la atención para investigar nuevos enfoques terapéuticos en trastornos genéticos de la retina. Se están utilizando tres enfoques principales para administrar células o AAV en el espacio subretiniano, a saber, la ruta transcorneal, la ruta transescleral y la ruta pars plana (ver Figura 2). Las vías transcorneales y transesclerales se asocian con la formación de cataratas, sinequias, hemorragia coroidea y reflujo desde el lugar de la inyección 11,44,45,47,48,49. Adoptamos el enfoque de pars plana como una visualización directa del proceso de inyección, y el sitio de inyección se puede lograr en tiempo real bajo el microscopio.
Recientemente describimos un método que puede diferenciar células madre embrionarias humanas (hESCs) en progenitores de fotorreceptores bajo condiciones químicamente definidas y libres de xenos utilizando la isoforma de laminina recombinante específica de retina humana LN523. Dado que se encontró que LN523 estaba presente en la retina, planteamos la hipótesis de que el nicho de la matriz extracelular de la retina humana podría recapitularse in vitro y, por lo tanto, apoyar la diferenciación de los fotorreceptores de las hESC36. El análisis transcriptómico de una sola célula mostró que los progenitores fotorreceptores que coexpresan la homeobox de conos y la recoverina se generaron después de 32 días. Se utilizó un modelo de ratón mutante de degeneración retiniana 10 (rd10) que imita la retinosis pigmentaria humana autosómica para evaluar la eficacia de los progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 in vivo. Las células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC se inyectaron en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 en P20, donde la disfunción y degeneración de los fotoceptores están en curso36. Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC post-criopreservados y la administración en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 . Este método también se puede utilizar para administrar AAV, suspensiones celulares, péptidos o productos químicos en el espacio subretiniano en ratones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

La regeneración de células fotorreceptoras utilizando células madre pluripotentes humanas es una terapia prometedora para el tratamiento de enfermedades de la retina hereditarias y de envejecimiento en etapas avanzadas. Hemos demostrado que la matriz de isoformas de laminina específica de retina recombinante humana es capaz de apoyar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) a progenitores de fotorreceptores. Además, la inyección sub-retiniana de estas células también ha mostrado una restauración parcial en los modelos de roedores y conejos rd10 . Se sabe que la inyección subretiniana es un método establecido que se ha utilizado para administrar compuestos farmacéuticos a las células fotorreceptoras y a la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR) del ojo debido a su proximidad al espacio objetivo. También se ha utilizado para administrar vectores virales adenoasociados en el espacio subretiniano para tratar enfermedades de la retina. La administración sub-retiniana de compuestos farmacéuticos y células en el modelo murino es un desafío debido a la restricción en el tamaño del globo ocular murino. Este protocolo describe el procedimiento detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para inyección y la técnica de administración sub-retiniana de estas células en ratones con mutación de retinosis pigmentaria genética, rd10 . Este enfoque permite la terapia celular en el área objetivo, en particular la capa nuclear externa de la retina, donde se producen las enfermedades que conducen a la degeneración de los fotorreceptores.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

Autor destacado: Avance de la restauración de la visión: terapia basada en células madre para enfermedades de la retina 

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

La jeringa de vidrio de 10 μL se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1), y la aguja roma utilizada para administrar la suspensión/medio celular se muestra en la Figura 1B. En la Figura 2 se ilustran diferentes enfoques para la inyección subretiniana. Describimos el enfoque de pars plana en este protocolo (Figura 2C). La aguja roma montada en una jeringa de vidrio se inse...

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Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Mi investigación se centra en el desarrollo de terapias basadas en células madre para estadios avanzados de enfermedades de la retina que causan degeneración de fotorreceptores. El objetivo de nuestra investigación es reemplazar la pérdida de fotorreceptores en pacientes con progenitores fotorreceptores clínicamente seguros y funcionales con el objetivo de mejorar su agudeza visual o incluso restaurar su visión. El principal modelo preclínico son los ratones, pero su pequeño tamaño ocular dificulta la inyección de materiales, especialmente debajo de la retina.Desarrollar la habilidad para realizar inyecciones subretinianas exitosas requiere paciencia y perseverancia. Hemos desarrollado con éxito una base de laminina para el método de diferenciación de receptores que es capaz de generar progenitores fotorreceptores en 32 días. Los trasplantes subretinianos de las suspensiones celulares de este progenitor fotorreceptor en los roedores dieron lugar a una conectividad sináptica entre los orificios y el injerto en los ojos.Esto ha llevado a una restauración visual parcial. Nuestro enfoque es simple, la visualización correcta ayuda al cirujano a manejar la aguja en el área de interés.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

669 vistas.  Singapore Eye Research Institute. Mi investigación se centra en el desarrollo de terapias basadas en células madre para estadios avanzados de enfermedades de la retina que causan degeneración de fotorreceptores. El objetivo de nuestra investigación es reemplazar la pérdida de fotorreceptores en pacientes con progenitores fotorreceptores clínicamente seguros y funcionales con el objetivo de mejorar su agudeza visual o incluso restaurar su visión. El principal modelo preclínico son los ratones, pero su pequeño tamaño ...

Video: Autor destacado: Avance de la restauración de la visión: terapia basada en células madre para enfermedades de la retina 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Investigación

Medicina

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

Reactivación de los progenitores fotorreceptores derivados de hESC criopreservados del día 32

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.