In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

Para comenzar, enjuague la cámara superior de las placas de 24 pocillos con PBS. Mezcle las celdas BEND3 con el medio DMEM usando un mezclador de vórtice para hacer una suspensión. A continuación, siembre 200 microlitros de suspensión celular BEND3 en la membrana de PET en la cámara superior de una placa de 24 pocillos.

Agregue 1, 200 microlitros de medio completo a la cámara inferior de la placa para estabilizar la presión osmótica de las cámaras superior e inferior. Cambie el medio retirando lentamente el medio viejo de un lado con una pipeta de presión negativa y añadiendo un nuevo medio a lo largo de la pared durante el intercambio de fluidos. Antes de medir TEER, coloque la resistencia, la solución de hipoclorito de sodio al 5%, el etanol al 75% y el agua destilada doble sobre una mesa ultra limpia.

Encienda la irradiación UV durante 30 minutos para eliminar las bacterias y patógenos residuales. Coloque los electrodos en una solución de hipoclorito de sodio al 5% agitando lentamente durante tres a cinco segundos. Luego sumérjalo en etanol al 75% durante 15 minutos.

Finalmente, transfiera a PBS o agua destilada doble hasta su uso. A continuación, encienda el interruptor en la parte posterior del medidor de resistencia de celda. Haga clic en Seleccionar placa y Seleccionar placa de 24 pocillos.

De acuerdo con la operación, seleccione la secuencia de detección adecuada. Inserte una resistencia de kilo ohmios en el enchufe derecho para calibrar el instrumento. Si el resultado de la calibración es 1000 más menos 5 ohmios, considere que el instrumento es preciso.

De lo contrario, haga clic en Unidades de modo en la interfaz principal para seleccionar Ohmios y luego haga clic en Calibrar. Luego, retire la resistencia de kilo ohmios y reemplácela con el electrodo de medición con un cable de conexión. Coloque el electrodo verticalmente en la placa de 24 pocillos que contiene solo medio y haga clic en Manipulación de piezas en bruto en el instrumento.

El valor de fondo de la resistencia de la placa sin celdas asentadas debe ser de aproximadamente 134,4 ohmios. A continuación, inserte los dos electrodos en las cámaras superior e inferior de la placa asentada, de modo que la capa de celda quede entre ellos. Registre el valor de resistencia pisando suavemente el pedal.

Asegúrese de que el electrodo no toque las celdas de la cámara superior y la parte inferior de la cámara inferior. Obtenga los valores de TEER multiplicando los valores de resistencia eléctrica por el área inferior de la cámara superior, como se muestra en la ecuación. Dibuja un diagrama lineal de TEER frente al tiempo en días.

Cuando el valor de resistencia no aumenta con el tiempo, las células han formado una barrera. Los valores de resistencia trazados en función del tiempo para las células BEND3 mostraron que los valores de TEER de las células comenzaron a estabilizarse al quinto día.