Para identificar las células del nicho limbal o LNC mediante tinción de inmunofluorescencia, agregue 1 mililitro de EDTA de tripsina al 0,25 % por pocillo a los LNC cultivados en una placa de 6 pocillos recubierta de matrigel al 5 %. Digiere las células incubando la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Apague la digestión agregando 1 mililitro de suero knockout que contenga MESCM a la suspensión celular.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga y centrifugue 200G durante cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de MESCM. A continuación, utilizando un citofugio, deposite 80 microlitros de la suspensión celular en partes iguales en cuatro portaobjetos de microscopio según las instrucciones del fabricante.
Fije las células con paraformaldehído al 4% durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, permeabilice las células de los portaobjetos utilizando Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 minutos. Bloquee las células con albúmina sérica bovina al 2% durante una hora antes de incubarlas con anticuerpos primarios en un agitador durante la noche a 4 grados centígrados.
Después de la incubación, elimine los anticuerpos no unidos lavando los portaobjetos con PBST tres veces durante cinco minutos cada uno. A continuación, incubar la muestra con anticuerpos secundarios adecuados a 37 grados centígrados durante una hora antes de lavar los anticuerpos no unidos, como se ha demostrado anteriormente. Contratiñir los núcleos con DAPI que tenga una concentración de 5 microgramos por mililitro.
Después de sellar los portaobjetos, realice la obtención de imágenes con un microscopio de fluorescencia. Usando un kit de aislamiento de ARN, extraiga el ARN total de los LNC según las instrucciones del fabricante. Luego, usando un kit de transcripción de ADN complementario o CDNA de alta capacidad, transcriba inversamente de 1 a 2 microgramos del ARN.
Prepare una solución de 20 microlitros que contenga 2,5 microlitros del CDNA, 0,8 microlitros del cebador genético correspondiente, 10 microlitros de una mezcla maestra de PCR universal y 6,7 microlitros de agua bidestilada. A continuación, realice una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa utilizando las condiciones adecuadas. Por último, emplee la técnica de TC comparativa para examinar la expresión génica relativa.
La doble tinción inmunológica de los LNC del cuarto paso reveló claramente que estas células eran consistentemente negativas para panCK, VIM positivas, CD90 positivas, CD105 positivas, SCF positivas y PDGFR positivas.
