Este método identifica los microorganismos conjuntivales oculares viables, que es desafiando debido al ambiente hostil de los ojos. Puede ayudar a responder si existe un microbioma ocular y cómo cambia la presencia bacteriana en la enfermedad ocular. En contraste con la secuenciación de ADN, que identifica microorganismos viables e inviables, este método identifica solo microorganismos viables, lo que resulta en una comprensión más clara de la comunidad comensal ocular.
Los estudios sugieren que las enfermedades oculares difíciles de diagnosticar tales como ojo seco no autoinmune y autoinmune tengan presencia bacteriana ocular única. Este método se podía utilizar para diagnosticar enfermedades de ojo con las firmas microbianas distintivas. Comience por autoclave de la cantidad adecuada de bateo de algodón y palillos de dientes para el número de ratones a ser hisopados, a continuación, pellizcar 1/2 un centímetro de largo pedazo de algodón de bateo y burlarse tirando de los bordes para formar una sola capa porosa plana que se detiene justo antes de que el bateo se deshace.
Gire el bateo alrededor de uno de los extremos afilados del palillo de dientes sosteniendo ligeramente la pieza estirada en la punta del palillo de dientes a medida que se tuerce. El hisopo de ojo terminado tendrá una capa muy delgada de algodón estirada sobre la punta que se extiende aproximadamente 1/2 a un centímetro de distancia de la punta. Inserte los hisopos en un pequeño casto, haga un hisopo lateral hacia abajo y luego cúbralos y autoclave.
Limpie el área de trabajo con un desinfectante para minimizar la contaminación y alícuota 0.5 mililitros de infusión estéril de corazón cerebral, o medios BHI en tubos de microcentrifugación estériles etiquetados de 1.5 mililitros. Tapar los tubos en un rack y poner el rack en hielo. Configure el flujo de trabajo de izquierda a derecha comenzando con la estación de anestesia del ratón, que contiene la jaula con los ratones experimentales, la jaula estéril vacía, la anestesia a temperatura ambiente, la aguja calibre 25 y una jeringa de un mililitro.
A continuación, prepare una estación de hisopado ocular que contenga el IMC alícuota en el hielo, hisopos oculares esterilizados, gotas lubricantes para los ojos, recipientes de riesgo biológico, toallas de papel limpias y aerosol de isopropanol al 70%. Finalmente, configure la estación de chapado con placas de agar sangre a temperatura ambiente, una pipeta de 10 microlitr, 10 puntas desechables estériles de microlitro y un contenedor de residuos de riesgo biológico. Asegúrese de que el ratón está correctamente anestesiado apretando una almohadilla del pie trasero.
Sólo proceder si no hay movimiento. Asigne una mano para manejar ratones anestesiados y las otras manos para manejar el hisopo del ojo y la cultura. Retire el ratón de la jaula y colóelo encima de la superficie de trabajo colocada de lado con el ojo izquierdo expuesto.
Rocíe las manos enguantadas con isopropanol y séquelas con una toalla de papel. Descapspeje el tubo de micro centrífuga BHI etiquetado con la mano de manejo de medios dedicada y coloque los dos de nuevo en el rack. Sumerja la punta recubierta de algodón del hisopo ocular en el IMC, luego retire el hisopo del tubo mientras arremolina la punta dos veces contra el tubo interno para eliminar el exceso de líquido y eliminarlo.
Con la mano de manejo del ratón, sostenga suavemente el ratón por el desaliño del cuello. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo. Deprima ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo en un movimiento de lavado de ventanas entre el párpado inferior y el ojo 10 veces, manteniendo una presión constante.
Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo perpendicular a donde se insertó. Coloque el lado de algodón hisopo hacia abajo, directamente en un tubo de micro centrífuga etiquetado con medios BHI. Aplique una gota para los ojos en el ojo hisopado.
Si lo desea, adquiera hisopos de piel o piel para muestras de control, esterilizando los guantes adecuadamente entre cada hisopo. Cuando haya terminado, devuelva el ratón a la jaula. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos sobre hielo, luego esterilice las manos enguantadas y retire el hisopo mientras mezcla la punta en el medio durante 10 rotaciones.
Retire el hisopo arremolinando la punta contra la pared interna del tubo durante cinco rotaciones y deséchelo en un recipiente de riesgo biológico. Repita el proceso para cada ratón. Enriquezca la muestra incubando el tubo estáticamente durante una hora a 37 grados Centígrados.
Durante la incubación, etiquete una placa de TSA a temperatura ambiente por hisopo de ojo de ratón o controle el hisopo y divídalo por la mitad. Retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelas en hielo. Brevemente vórtice las muestras a mezclar, luego alícuota 10 microlitros de la muestra en la placa TSA e incline la placa para formar una tira.
Repita esto dos veces. En el otro lado de la línea divisoria de placas, cree 10 puntos con 10 microlitros de muestra cada uno. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 18 horas, dos días y cuatro días en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen.
Cuente las colonias en las tiras. Tenga en cuenta la morfología y calcule las unidades formantes de colonias por hisopo para aislados morfológicamente similares. Mira los puntos donde los organismos únicos no son capturados en las tiras.
Para facilitar la visualización, plateamos las bacterias densamente en las placas central y derecha. Típicamente, observamos muchas menos bacterias en las placas de hisopos oculares. Tenga en cuenta que en ocasiones, los hisopos oculares pueden no producir bacterias recuperables.
Una placa representativa de la hisopo del ojo con aislantes morfológicamente diversos de un ratón negro C57 seis se muestra aquí. Para cada aislante distinto, las colonias fueron contadas en la tira y la abundancia relativa fue calculada y trazada. Para la caracterización microbiológica, las bacterias se seleccionaron de placas individuales de hisopo de ojo de ratón para producir una placa maestra de TSA.
Cuando apareció el crecimiento, se realizaron pruebas adicionales para caracterizar o identificar los microbios. La placa maestra fue utilizada para proporcionar bastante inóculo para ampliar los aislantes respectivos. Para identificar aislantes, una placa de TSA fue rayada e incubada durante la noche, y el ms de MALDI-TOF fue realizado.
Los ejemplos de aislantes mostrados aquí fueron identificados como estreptococo acidominimus y viridans de Aerococcus. Niveles perceptiblemente diversos de organismos commensales fueron recuperados de los ratones negros masculinos y femeninos C57 seis. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagula estafilococos negativos y E.coli se aislaron de C57 negro seis ratones N.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el mejor resultado se logrará recubriendo el hisopo finamente y tomando tiempo durante el paso del hisopo ocular. Si el acceso a MALDI-TOF MS es limitado, entonces los aislados pueden ser identificados por pruebas microbiológicas y bioquímicas.
