Los autores agradecen a Ruth Zelkha, MS, por su generosa ayuda en la formación de imágenes. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo Clínico Científico Premio K12EY021475 a mí, conceder R01 EY024349-01A1 de ARD, el núcleo EY01792 subvención del Instituto Nacional del Ojo, NIH, y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera. ARD es el destinatario de un Premio desarrollo de la carrera de investigación para prevenir la ceguera.

Todos los procedimientos realizados en animales cumplen con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaraciones para el uso de animales en la investigación de la visión. Se utilizaron cuatro a catorce 6J de seis meses de edad, macho / hembra C57BL / tipo salvaje: diez ratones para el modelo de lesión y cuatro como animales de control (córneas no heridos). 1. Preparación de los animales <ol><li> Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de una 100 mg / kg de ketamina y 5 mg mezcla de xilazina / kg. Después de la anestesia ha hecho efecto, pellizcar el dedo para confirmar la profundidad de la anestesia; el animal no debe reaccionar. </li><li> Inspeccionar el ojo bajo una lámpara de hendidura antes de realizar los experimentos para comprobar la ausencia de cualquier lesión en la córnea anterior. </li><li> Inculcar una gota de clorhidrato de tetracaína 1% sobre el ojo. Después de 60 - 90 segundos, probar el reflejo corneal para confirmar la ausencia de sensación. Proparacaína clorhidrato de 0,5% se puede usar en su lugar. </li><li> Cuando la pérdida de sensación corneal escierto, coloque suavemente una gota de 5% de povidona-yodo en el ojo y en el cabello alrededor del ojo. Limpie la gota después de 1 min o difundirlo en el pelo alrededor de los ojos para evitar que el pelo interfiera con la punta de la herramienta. </li></ol> 2. Dispositivo de abrasión del epitelio corneal <ol><li> Use guantes quirúrgicos y una bata. Preparar las herramientas necesarias: una fresa rotativa estéril y un par de pinzas estériles. Para un mejor control, utilizar pinzas dobladas. Coloque las herramientas en una hoja estéril durante el procedimiento. </li><li> Usando las pinzas dobladas, estabilizar el ojo por el acaparamiento de las tapas desde el lado nasal y proptosing suavemente el ojo. Evitar el uso de demasiada presión. </li><li> Bajo un microscopio quirúrgico, afeitarse 360 ​​° alrededor de la zona del limbo dos veces utilizando la fresa rotativa estéril. Ir alrededor del limbo con una velocidad de 5-6 seg por ronda. NOTA: La rebaba tiene una velocidad fija. Sin embargo, para que gire a la velocidad establecida, la &quot;tuerca del extremo&quot; debe estar completamente apretado. </li><li> Retire todo el epitelio de la córnea de limbo a limbo con la rebaba rotatoria. Para obtener mejores resultados, mueva la herramienta en forma circular y mantenga un tanto paralela a la superficie de la córnea para trabajar con la parte lateral de la punta. Tenga cuidado de no dañar el estroma por no vuelve a cepillar las áreas donde el epitelio ya ha sido retirado. No aplicar ninguna presión en el ojo. Limpiar la punta del pincel según sea necesario. </li><li> Inculcar una gota de solución salina tamponada con fosfato estéril sobre la córnea y limpie las hojas epiteliales independiente con un tejido suave de limpieza. </li><li> Afeitarse el epitelio restante, en su caso. </li><li> Prestar atención a la cola del ratón durante la cirugía. NOTA: Si se produce cualquier movimiento, la profundidad de la anestesia se ha desvanecido y se requiere aún más la inyección. Un tercio a dos tercios del volumen inyectado primario debe ser suficiente. No exceder la dosis al animal con la medicación anestésica. </li><li> Esterilizar todas las herramientas antes de utilizarlas en otro ojo. </li></ol> 3. Confirmar la eliminación completa epitelial <ol><li> Aplicar una gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio en la córnea. Limpiar la córnea después de 30 segundos y examinarla bajo el microscopio con un filtro azul de cobalto para verificar la eliminación completa del epitelio. NOTA: Las áreas de la córnea con defectos epiteliales se visualizan en verde. </li></ol> 4. Después de la operación de atención <ol><li> El sacrificio del animal en una manta de calefacción y guardarlo en un lugar seguro (por ejemplo, en su jaula), mientras que bajo la recuperación. No mantenga un animal inconsciente en compañía de los conscientes. </li><li> Aplicar 1% pomada oftálmica de eritromicina. Esto también evitará que la sequedad del ojo. Continuar la aplicación del antibiótico diaria durante una semana. </li><li> Inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea después del procedimiento y de nuevo después de 12 hr. Continuar la inyección dos veces al día durante dos días. </li><li> Observe que el animal de 30 - 45 minutos, hasta que la recuperación completa de la anestesia. NOTA: Leve movimiento de los músculos respiratorios en la superficie ventral indica el bienestar de los animales, mientras que bajo la recuperación. </li></ol>

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	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

En este artículo se describe una técnica reproducible y relativamente sencillo para crear un modelo de ratón de LSCD. Hay varios aspectos importantes de este modelo que vale la pena destacar. En primer lugar, a diferencia de los modelos que utilizan productos químicos 11, 12, la lesión implica principalmente el epitelio de la superficie (y la membrana basal), con un daño mínimo al estroma corneal subyacente o a otras estructuras intraoculares. Por lo tanto, no hay más que la inflamación y la cicatriz...

Se requiere que el epitelio de la córnea para mantener la claridad y la integridad de la córnea. Se renueva constantemente durante toda la vida de las células madre epiteliales que residen en el limbo-una zona estrecha en la unión de la córnea y la conjuntiva. Estas células madre limbares auto-renovación juegan un papel crucial en la regeneración del epitelio corneal, tanto normalmente y después de la lesión. agotamiento parcial o completa de estas células madre dará lugar a erosiones corneales recurrentes, dolor, cicatrización de la córnea y la neovascularización, la apariencia de las células caliciformes, y si se deja sin tratar la ceguera, la córnea. Esta condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) y puede ser idiopática; hereditario; o adquirida debido a las lesiones químicas o térmicas, lentes de contacto a largo plazo desgaste, y la inflamación crónica 1-6. La investigación sobre SIL requiere un modelo animal adecuado que no sólo imita la enfermedad en los seres humanos, pero es reproducible y sostenible, con el mínimo de unamonte de lesiones en otras estructuras de la córnea y oculares. Este modelo es necesaria para evaluar los tratamientos y para aclarar los mecanismos de la enfermedad a nivel molecular y celular. Como se ha descrito antes de 1, con el uso de una fresa giratoria, se puede desarrollar fácilmente un modelo de ratón de LSCD que cuenta con las ventajas antes mencionadas y persiste durante al menos tres meses. El objetivo de este estudio es presentar un modelo simple, reproducible y sostenible del ratón de SIL. La fresa de rotación es una práctica herramienta que elimina de manera uniforme el epitelio sin dañar el estroma subyacente 1. Se ha utilizado para inducir la erosión corneal central 7, 8 en los estudios de cicatrización de heridas. La técnica de la presente-presentado para crear LSCD en un ratón no se ha informado antes. Anteriormente introducido métodos de raspar el epitelio con un resultado espátula roma en una lesión menos uniforme, particularmente en el limbo y un fenotipo más variable 1, 9, con más o restauraciónf epitelio corneal normal de 1. A diferencia del raspador romo, la rebaba giratorio elimina la membrana basal epitelial, así 7, 8, 10. Otros métodos reportados por separar las células madre implican el uso de productos químicos, tales como hidróxido de sodio, n-heptanol, y cloruro de benzalconio, que no sólo puede inducir lesión no deseado a las estructuras del ojo subyacentes, sino que también puede conducir a la inflamación significativa y posterior opacificación corneal o epitelial metaplasia escamosa 11-15. La rebaba de rotación no está asociado con estas complicaciones graves. La extirpación quirúrgica del epitelio limbal, solo o con el uso de productos químicos 10, 11, 16, es más difícil de realizar y no es la mejor opción en los animales con ojos pequeños y una epitelio limbar delgada (como ratones). Además, sorprendentemente, limbectomy todavía puede dejar un poco del epitelio limbal detrás 10. La técnica descrita a continuación resultará en LSCD con una neovascularizaciónd conjuntivalización que imita la presentación del SIL completa en los pacientes y tiene una duración de al menos tres meses 1. Es adecuado para aquellos que tienen como objetivo estudiar la fisiopatología SIL o la cicatrización de heridas, la inmunología, y los tratamientos potenciales en ratones. Posiblemente, con algunas modificaciones, este procedimiento puede llevarse a cabo en ratas o conejos 10. Como la rebaba giratorio elimina eficazmente el epitelio, que se puede utilizar en cualquier investigación perteneciente a la abrasión corneal epitelial / herida y en cualquier tratamiento relacionado o estudios de biología molecular.

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

insuficiencia límbica (SIL) es un estado de mal funcionamiento o pérdida de las células madre epiteliales del limbo, después de lo cual el epitelio corneal se reemplaza con la conjuntiva. Los pacientes que sufren de defectos corneales recurrentes, dolor, inflamación y pérdida de la visión. Anteriormente, se ha descrito un modelo murino de SIL y se comparó con otros dos modelos. El objetivo era producir un modelo de ratón consistente de SIL que tanto imita el fenotipo en los seres humanos y dura el tiempo suficiente para que sea posible estudiar la fisiopatología de la enfermedad y evaluar nuevos tratamientos. Aquí, la técnica se describe en más detalle. Una herramienta motorizada con una fresa rotativa ha sido diseñado para eliminar los anillos de óxido de la superficie de la córnea o para alisar la cama pterigión en los pacientes. Es un dispositivo adecuado para crear el modelo SIL deseado. Se trata de una herramienta de fácil de usar fácilmente disponible con una punta fina que la hace apropiada para trabajar en pequeños ojos, comoen ratones. Su aplicación evita trauma innecesario a la vista y que no da lugar a lesiones no deseados, como a menudo es el caso de modelos de lesión química. A diferencia de un raspador romo, que elimina el epitelio con la membrana basal. En este protocolo, la zona del limbo fue pulida dos veces, y luego todo el epitelio corneal se afeitó de limbo a limbo. Para evitar lesiones estroma, se tuvo cuidado de no rozar la superficie de la córnea una vez que el epitelio ya se había eliminado.

Dentro de un mes después de realizar esta técnica, el 100% de las corneas desarrolló neovascularización superficial (Figura 1A. Las fotografías fueron tomadas con una cámara conectada a una lámpara de hendidura bajo un campo brillante y cobalto filtro azul). En 18/20 (90%) de los ojos, la neovascularización implicada toda la superficie corneal (Figura 1A). En 2/20 (10%), se observó neovascularización en tres de los cuatro cuadrantes de la córn...

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K vistas.  University of Illinois at Chicago.  El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo. 

Video: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Investigación

Medicina

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Biología del Desarrollo

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurociencias

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Un método de punción de biopsia modificado para quemaduras precisas de álcali en ratones

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

Autor destacado: Avance de la investigación en el tratamiento y la regeneración de la opacidad corneal 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

Inducción de lesiones corneales y alcalinas mediante una técnica de punzón y trefina en un modelo de ratón

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

Revitalización de la vista: terapia con células madre para la degeneración de la retina

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Autor destacado: Avance de la restauración de la visión: terapia basada en células madre para enfermedades de la retina 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Resumen

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Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

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Inducción de lesiones corneales y alcalinas mediante una técnica de punzón y trefina en un modelo de ratón

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Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10