Para comenzar, tome la muestra de vesícula extracelular seca obtenida de la orina humana utilizando el enfoque de trampa EV. Prepare un tampón de lisis nuevo con los componentes mostrados. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de lisis para solubilizar la muestra seca de EV.
Calentar la muestra a 95 grados centígrados durante 10 minutos mientras se agita a 1,100 RPM. Después de enfriar la muestra a temperatura ambiente, dilúyala cinco veces agregando 400 microlitros de TEAB de 50 milimolares. Mida la concentración de proteínas con un kit de ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Agregue la mezcla de tripsina y lisina C a la muestra e incube a 37 grados centígrados durante la noche con agitación a 1, 100 RPM. A continuación, añadir 50 microlitros de ácido trifluoroacético al 10% o TFA para acidificar la muestra. Además, agregue 600 microlitros de acetato de etilo a las muestras y agite la mezcla durante dos minutos.
Centrifugar la muestra durante tres minutos a 20.000 G y retirar con cuidado la capa superior sin alterar la interfaz. Secar la fase acuosa con un concentrador centrífugo de vacío. Ahora vuelva a suspender la muestra seca en 200 microlitros de 0,1% de TFA para acidificar los péptidos.
Para desalar la muestra, utilizar una punta desalinizadora de CA18 y acondicionarla con 200 microlitros de 0,1% de AGT y acetonitrilo al 80%, seguido de dos lavados con 200 microlitros de AGT al 0,1%. Cargue la muestra de péptido acidificado en la punta y lávela tres veces con 200 microlitros de 0,1% de TFA. Eluir los péptidos con 200 microlitros de 0,1% de TFA y 80% de acetonitrilo.
Después de extraer el eluyente como se ha demostrado, vuelva a suspender la muestra seca a fosfoproteómica en 200 microlitros de tampón de carga para el enriquecimiento de fosfopéptidos. Agregue 50 microlitros de las perlas a la muestra y agite vigorosamente durante 20 minutos a temperatura ambiente. Cargar la muestra con las perlas en la punta fritada y centrifugar durante un minuto a 100 G. Lavar la punta sucesivamente con 200 microlitros de tampón de carga, lavando los tampones uno y dos.
Coloque la punta con perlas en un tubo nuevo para recoger los fosfopéptidos eluidos. Añadir 50 microlitros de tampón de elución a la punta y centrifugar durante dos minutos a 20 G. A continuación, secar los fosfopéptidos eludidos con un concentrador de centrífuga al vacío.
