Para comenzar, prepare muestras de proteoma y fosfoproteoma de las vesículas extracelulares aisladas de las muestras de orina utilizando el enfoque EVtrap. Inyecte las muestras en el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de movilidad iónica atrapada a través del sistema de cromatografía líquida. Separe los péptidos en una columna C18 de 15 centímetros.
Para el análisis proteómico, adquiera datos utilizando el método dia-PASEF con un rango de masa por rampa que abarque de 300 a 1200 relación masa-carga y una constante de movilidad iónica de 0,6 a 1,50 1/nudo. Para el análisis de fosfoproteómica, adquiera datos utilizando un método de adquisición dia-PASEF. Establezca el rango de masa por rampa para que abarque de 400 a 1550 relación masa-carga en constante de movilidad iónica de 0,6 a 1,50 1/nudo.
Cargue los archivos RAW en el software proteómico. Configure los parámetros de búsqueda en la base de datos de homo sapiens. En Tipo de resumen, seleccione Específico y, en Enzimas, seleccione TripsinP.
Defina la longitud del péptido en un mínimo de 7 y un máximo de 52 y permita dos escisiones perdidas. A continuación, establezca el Máximo de modificaciones de variables en 5. La modificación fija debe ser carbamidometilo en cistina, mientras que las modificaciones variables deben incluir acetilproteína N-terminal, oxidación en metionina y fosforilación en serina, treonina y tirosina.
Por último, establezca la tasa de falsos descubrimientos para la coincidencia del espectro peptídico, el péptido y el grupo de proteínas en 0,01. En el perfil proteómico de LCMS y MS, el 2% de cada muestra reveló más de 11.000 péptidos únicos de aproximadamente 2.200 proteínas. En particular, el 72% de las proteínas únicas se encontraron consistentemente en las tres réplicas y se identificaron 90 marcadores y proteínas principales de EV en comparación con la base de datos ExoCarta.
La precisión cuantitativa se confirmó con un coeficiente de variación bajo-medio de 5,7%, lo que significa una alta reproducibilidad y fiabilidad. En el caso de la fosfoproteómica, el 98% de cada muestra peptídica produjo 800 fosfopéptidos únicos y 350 fosfoproteínas. El enriquecimiento dio como resultado péptidos de fosfoserina al 72%, fosfotreonina al 22% y fosfotirosina al 6%.
Se identificó el 42% de los fosfopéptidos en todas las réplicas en un coeficiente de variación medio del 21,8%, lo que indica una reproducibilidad cuantitativa aceptable.
