High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

Con una pipeta serológica, coloque cuidadosamente cuatro mililitros de sangre humana heparinizada sobre ocho mililitros de medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar la sangre a 550 g durante 30 a 50 minutos a 20 grados centígrados. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para eliminar la capa superior que contiene plasma y células mononucleares.

Recoja los neutrófilos de la banda turbia inferior y aproximadamente de tres a cuatro mililitros por debajo del líquido transparente en un tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS. Invierta suavemente el tubo dos o tres veces para mezclar la suspensión de neutrófilos. Centrifugar la suspensión de neutrófilos a 400G durante 10 minutos a 20 grados centígrados, luego decantar cuidadosamente el sobrenadante del tubo y volver a suspender el gránulo en cinco mililitros de PBS.

De nuevo, centrifuga la suspensión a 300G durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Después de quitar el sobrenadante, use succión al vacío para eliminar el sobrenadante residual en la pared del tubo y alrededor de la boca del tubo. Resuspenda el pellet en un mililitro de medio neutrófilo.

Combine un mililitro de solución de anticuerpos de 1,2 microgramos por mililitro con 0,2 mililitros de medio neutrófilo en un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos a los pocillos de control negativo en una placa de 384 pocillos. En un tubo de 15 mililitros, combine nueve mililitros de la solución de anticuerpos, 21,6 microlitros de la solución FMLP y 1,7784 mililitros de medio neutrófilo.

Agregue 25 microlitros de esta mezcla al control positivo y pruebe los pocillos en una placa de 384 pocillos. Con una pipeta multicanal, transfiera cinco microlitros de solución compuesta de la placa de biblioteca de compuestos a la placa de 384 pocillos. Centrifugar la suspensión a 500 G durante un minuto.

Agregue 20 microlitros de suspensión de neutrófilos a cada pocillo con una pipeta de 16 canales. Incubar la placa en una coctelera a 300 RPM durante 10 minutos. Luego, para fijar las células, agregue tres microlitros de paraformaldehído al 16% a cada pocillo e incube en hielo durante 10 minutos.