Agradecemos al Dr. Evan Jellison y a la Sra. Li Zhu del núcleo de citometría de flujo de UConn Health por su ayuda con la citometría de flujo, a la Dra. Lynn Puddington del Departamento de Inmunología de UConn Health por su apoyo a los instrumentos, a la Sra. Slawa Gajewska y al Dr. Paul Appleton del núcleo de investigación clínica de UConn Health por su ayuda en la obtención de muestras de sangre. Agradecemos al Dr. Christopher "Kit" Bonin y a la Dra. Geneva Hargis de la Facultad de Medicina de UConn por su ayuda con la redacción científica y la edición de este manuscrito. Esta investigación contó con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R01HL145454), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM121176), EE. UU., un Premio al Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34110426) y un fondo inicial de UConn Health. La figura 1 se creó con BioRender.com.

Se obtuvieron muestras de sangre entera heparinizadas de donantes humanos sanos no identificados después de obtener el consentimiento informado, según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UConn Health, siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes. Los criterios de inclusión/exclusión para este estudio se desarrollaron cuidadosamente para garantizar la idoneidad de los participantes y minimizar los riesgos potenciales. Los participantes elegibles tenían entre 18 y 65 años, eran de cualquier etnia, hablaban inglés con fluidez y eran capaces de dar su consentimiento informado. Entre los participantes excluidos se encontraban aquellos que no podían dar su consentimiento informado por sí mismos, como los que requerían un representante legalmente autorizado, las personas menores de 18 años o mayores de 65 años, las personas encarceladas y las mujeres embarazadas. Además, los participantes tenían que estar libres del uso de medicamentos antiinflamatorios y de afecciones inflamatorias. Las infecciones actuales o las afecciones inflamatorias crónicas o agudas en curso también fueron criterios de exclusión. Por último, las personas con antecedentes actuales o recientes de infección por COVID-19 no fueron elegibles para el estudio. Estos criterios se diseñaron para garantizar la seguridad y la idoneidad de los participantes y, al mismo tiempo, minimizar los posibles factores de confusión que podrían afectar los resultados del estudio.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Medio de neutrófilos: Prepare el medio de neutrófilos añadiendo un 2% de albúmina sérica humana a RPMI-1640 sin rojo de fenol (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Solución fMLP: Prepare la solución fMLP diluyéndola 100 veces a partir de la solución de almacenamiento de dimetilsulfóxido (DMSO) de fMLP de 10 mM (consulte la Tabla de materiales) con RPMI 1640 sin rojo de fenol, lo que da como resultado una solución de fMLP de 100 μM.</li>
	<li>Solución de anticuerpos: Diluir 120 μL de anticuerpo monoclonal conjugado con aloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ver Tabla de Materiales), que informa de la conformación de alta afinidad de la integrina β2, en 10 mL de medio neutrófilo, creando una solución de mAb24-APC de 1,2 μg/mL.</li>
	<li>Biblioteca de compuestos: Diluya la biblioteca de compuestos inicial con una concentración de 10 mM a 1 mM agregando 5 μL de la biblioteca de 10 mM (consulte la Tabla de materiales) a 45 μL de DMSO en placas de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos. Posteriormente, transfiera 5 μL por pocillo de la biblioteca de compuestos de 1 mM a una placa vacía de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos.</li>
	<li>Como se ilustra en la Figura 1, cuatro columnas ( 1, 2, 23, 24) contenían solo DMSO pero no compuestos, que sirvieron como controles positivos y negativos en el cribado. Diluya aún más cada pocillo agregando 45 μL de RPMI-1640 sin rojo de fenol, lo que da como resultado una concentración final de 100 μM para todos los compuestos.</li>
</ol>2. Aislamiento de neutrófilos de sangre humana
<ol><li>Con una pipeta serológica, coloque cuidadosamente 4 ml de sangre sobre 8 ml de un medio de gradiente de densidad disponible comercialmente (véase la tabla de materiales) en un tubo de centrífuga de 15 ml (Figura 2A).</li>
	<li>Centrifugar la sangre a 550 × g durante 30-50 min a 20 °C. Desacelerar el rotor gradualmente (factor de desaceleración de 1). NOTA: La separación exitosa de los neutrófilos (banda 2 en la Figura 2B) de los glóbulos rojos puede variar entre los donantes. Para la mayoría de los donantes, una centrifugación de 30 minutos es suficiente. Sin embargo, para algunos donantes, es posible que se requieran 10-30 minutos adicionales de centrifugación si la separación no tiene éxito (Figura 2C).</li>
	<li>Retire con cuidado el plasma (el líquido amarillo en la parte superior) y las células mononucleares (la banda turbia superior; PBMC en la Figura 2B) utilizando una pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Recoja los neutrófilos de la banda turbia inferior (banda de neutrófilos en la Figura 2B) y aproximadamente 3-4 ml por debajo del líquido transparente en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mezcle suavemente la suspensión de neutrófilos invirtiéndola 2-3 veces.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 400 × g durante 10 min a 20 °C y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante por decantación.</li>
	<li>Resuspender suavemente el pellet con 5 ml de PBS y centrifugarlo a 300 × g durante 5 min a 20 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante por decantación y elimine con cuidado cualquier sobrenadante residual alrededor de la boca del tubo y en la pared del tubo mediante succión al vacío. Vuelva a suspender el gránulo en 1 mL de medio neutrófilo.</li>
	<li>Cuente el número de células con un hemocitómetro. Típicamente, se obtuvieron de 1 a 4 × 107 neutrófilos a partir de 8 mL de sangre humana. NOTA: Puede haber contaminación de glóbulos rojos en la suspensión de neutrófilos. Los glóbulos rojos no afectan significativamente a la mayoría de los ensayos y pueden prevenir la activación/cebado de los neutrófilos27. Los glóbulos rojos deben lisarse antes de contar para obtener una concentración precisa de neutrófilos. Añadir 10 μL de la suspensión celular a 891 μL de agua desionizada durante 10-30 s para lisar los glóbulos rojos, luego añadir 99 μL de PBS al 10× para equilibrar la presión osmótica, evitando la lisis de los neutrófilos.</li>
	<li>Ajuste la densidad celular a 6.25 × 105 células/mL agregando medio neutrófilo.</li>
</ol>3. Preparación de la placa de 384 pocillos
<ol><li>En un tubo de centrífuga de 1,5 ml, combine 1 ml de la solución de anticuerpos (1,2 μg/ml de mAb24-APC) con 0,2 ml de medio neutrófilo para crear una solución de mAb24-APC de 1 μg/ml. Luego, agregue 25 μL de esta mezcla a los pocillos de control negativo en una placa de 384 pocillos (los pocillos azules de la Figura 1).</li>
	<li>En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezcle 9 ml de la solución de anticuerpos con 21,6 μl de la solución de fMLP (100 μM) y 1,7784 ml de medio de neutrófilos para crear una solución que contenga 1 μg/ml de mAb24-APC y 200 nM de fMLP. A continuación, agregue 25 μL de esta mezcla a los pocillos de control positivo y de prueba en una placa de 384 pocillos (los pocillos rojo y azul de la Figura 1).</li>
	<li>Transfiera 5 μL de las soluciones compuestas de 100 μM de la placa de biblioteca de compuestos a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal.</li>
	<li>Centrifugar el líquido durante 1 min a 500 × g, a temperatura ambiente. NOTA: Para centrifugar placas, se requiere un rotor de cubeta oscilante y cucharones de placas.</li>
</ol>4. Tratamiento de las células
<ol><li>Agregue 20 μL de la suspensión de neutrófilos a cada pocillo usando una pipeta de 16 canales (rango de 5-50 μL, para cada columna de la placa de 384 pocillos). Mezcle suavemente de 5 a 10 veces con la pipeta, manteniendo un intervalo de tiempo constante entre cada pipeteo. NOTA: Las concentraciones finales en los pocillos son las siguientes: neutrófilos 2,5 × 105 células/mL (todos los pocillos); mAb24-APC 0,5 μg/mL (todos los pocillos); fMLP 100 nM (control positivo y pozos de prueba); compuestos 10 μM (pocillos de ensayo).</li>
	<li>Incubar la placa en un agitador a 300 rpm, a temperatura ambiente (RT), durante 10 min.</li>
	<li>Fije las celdas agregando 3 μL de paraformaldehído (PFA) al 16% a cada pocillo usando una pipeta de 16 canales (concentración final de PFA ~0.91%). Luego, incuba en hielo durante 10 min. NOTA: Se recomienda mantener un intervalo de tiempo constante entre las diferentes columnas al agregar neutrófilos y PFA. Esto garantiza que los neutrófilos de cada pocillo tengan el mismo tiempo de incubación con fMLP y mAb24-APC.</li>
</ol>5. Citometría de flujo
<ol><li>Encienda el citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales) y asegúrese de que la computadora conectada al instrumento también esté encendida.</li>
	<li>Asegúrese de que el contenedor de líquido de la vaina esté lleno y que el contenedor de desechos esté vacío y conectado correctamente al instrumento.</li>
	<li>Cargue la placa de 384 pocillos en el cargador de muestras del citómetro de flujo. Asegúrese de que el pocillo A1 de la placa esté alineado con la marca A1 del cargador.</li>
	<li>Abra el software y cree un nuevo experimento. Seleccione el pozo 384 y elija los fluoróforos deseados. A continuación, haga clic en Configuración de placa, arrastre para seleccionar todos los pocillos y luego haga clic en Muestra. Encienda el interruptor "Alto rendimiento" y seleccione Alto en el panel de velocidad.<ol><li>En el cuadro de volumen, escriba 50. Seleccione las muestras en columnas impares y luego active el interruptor "Agitación". Por último, asigne un nombre a las muestras en el panel derecho.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga clic en Trazar y puerta. Luego, haga clic en el botón Aplicar (dos flechas en un círculo lleno de verde) y, posteriormente, haga clic en el botón de reproducción (forma de triángulo). Espere unos segundos para observar algunas celdas del primer pozo y luego haga clic en el botón de pausa .<ol><li>Ajuste los voltajes FSC y SSC para garantizar una visualización adecuada de las celdas en la parcela. Haga clic en Adquisición y, a continuación, haga clic en el botón de reproducción (forma de triángulo) para iniciar el ensayo.</li>
	</ol></li>
	<li>El citómetro de flujo muestreará secuencialmente ~ 50 μL de 1000-3000 neutrófilos de cada pocillo. Se necesitarán aproximadamente 3 h para completar toda la placa de 384 pocillos.</li>
	<li>Después de completar todos los ejemplos, exporte los archivos .fcs para el siguiente paso.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo (consulte Tabla de materiales). Seleccione y arrastre la carpeta que contiene todos los archivos .fcs a la ventana del software y, a continuación, suéltela para importar los datos al software.</li>
	<li>Haga doble clic en una muestra, compuerta de neutrófilos individuales basados en FSC y SSC28,29,30 en la ventana emergente, como se muestra en la Figura 3. Seleccione las filas cerradas y arrástrelas a la carpeta, luego suéltelas para aplicar la compuerta a todas las muestras de esa carpeta.</li>
	<li>Calcule y exporte la intensidad media de fluorescencia (MFI) de APC de los neutrófilos de cada pocillo utilizando la función de editor de tablas del software. Haga clic en Agregar columna en la pestaña Editar . Seleccione Mediana en la pestaña Estadística , elija los neutrófilos de la población controlada y seleccione APC como parámetro. Haga clic en el botón Aceptar .</li>
	<li>Regrese a la pestaña "Editor de tablas", seleccione Todas las muestras en la pestaña "Grupo" y presione el botón Crear tabla . Aparecerá una nueva ventana que muestra la tabla creada. Guárdalo como un archivo de texto, CSV o Excel.</li>
	<li>Abra la tabla exportada, calcule el valor medio y la desviación estándar del IMF de APC para las muestras de control positivas y negativas (Figura 4).</li>
	<li>Calcula el factor Z' (Z') de la placa usando la ecuación: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), donde σ p y σ n son las desviaciones típicas de los controles positivos y negativos, respectivamente, y μp y μn son las medias de los controles positivos y negativos, respectivamente31. NOTA: El factor Z' indica la separación de las distribuciones de control positivo y negativo. Una Z' de 0 significa que no hay separación, mientras que una Z' de 0,5 indica una separación igual. Como se mencionó en un estudio anterior31, Z' > 0,5 indica un excelente ensayo para el cribado de compuestos. Una Z' en el rango de 0,5 a 0 es aceptable, pero es posible que solo identifique aciertos fuertes en el ensayo, lo que requerirá una validación adicional en ensayos secundarios.</li>
	<li>Considerar los compuestos como "aciertos" para el cribado cuando la IMF de APC de los neutrófilos tratados con compuestos es inferior a tres veces la desviación estándar de la IMF de control positivo restado de la IMF de control positivo (P = 0,0013, representada por la línea punteada de la Figura 4).</li>
</ol>

Cribado de inhibidores de la activación de integrinas β2 en neutrófilos humanos

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Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El inicio y la terminación de la estimulación y tinción de neutrófilos están determinados por la adición de neutrófilos y el fijador PFA. Por lo tanto, es fundamental garantizar el mismo intervalo de tiempo entre el pipeteo de neutrófilos o PFA en cada columna. Esto asegura que el tiempo de estimulación y tinción de los neutrófilos de cada pocillo permanezca constante. Debido a la corta vida útil de los neutrófilos, todo el experimento, desde la recolección de sangre de los donantes hasta la realización de...

Muchas enfermedades inflamatorias se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en el sitio de la hinchazón o lesión1. Para infiltrarse en estos tejidos, los neutrófilos deben completar la cascada de reclutamiento de neutrófilos, que implica la detención del endotelio, la extravasación a través de la pared del vaso y el reclutamiento en el tejido2. Los neutrófilos circulantes necesitan la activación de la integrina β2 para completar esta cascada, especialmente para la fase de detención. Por lo tanto, los fármacos inhibidores de integrinas que reducen la adhesión, la extravasación y el reclutamiento de neutrófilos pueden tratar eficazmente las enfermedades inflamatorias 3,4.
Las integrinas β2 han sido atacadas para enfermedades inflamatorias anteriormente. El efalizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido directamente a la integrina αLβ2, se desarrolló para tratar la psoriasis5. Sin embargo, el efalizumab fue retirado debido a su efecto secundario letal: leucoencefalopatía multifocal progresiva resultante de la reactivación del virus JC 6,7. Las nuevas terapias antiinflamatorias basadas en integrinas deben considerar el mantenimiento de las funciones antiinfecciosas de los leucocitos para minimizar los efectos secundarios. Los efectos secundarios del efalizumab podrían deberse a la circulación prolongada de anticuerpos monoclonales en el torrente sanguíneo, lo que podría inhibir las funciones inmunitarias a largo plazo8. Un estudio reciente muestra que efalizumab media la reticulación αLβ2 y la internalización no deseada de las integrinas α4, proporcionando una explicación alternativa para los efectos secundarios9. Por lo tanto, los antagonistas de moléculas pequeñas de corta duración podrían evitar este problema.
Aquí se presenta un método de alto rendimiento para cribar antagonistas de integrinas β2 de moléculas pequeñas utilizando neutrófilos humanos. La activación de la integrina β2 requiere cambios conformacionales del ectodominio de la integrina para acceder y aumentar su afinidad de unión a su ligando. En el modelo canónico de navaja, el ectodominio de integrina doblada-cerrada primero se extiende a una conformación extendida-cerrada y luego abre su casco a una conformación extendida-abierta completamente activada10,11,12,13. También existe una vía alternativa que parte de la curva-cerrada a la curva-abierta y extendida-abierta, eventualmente 14,15,16,17,18,19. El anticuerpo conformacional específico mAb24 se une a un epítopo en el dominio humano similar a β2-I cuando la cabeza del ectodominio está abierta20,21,22,23.
En este caso, se utiliza mAb24-APC para determinar si las integrinas β2 están activadas. Para activar los neutrófilos y la integrina, se utiliza como estímulo en este protocolo la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un péptido quimiotáctico corto derivado de bacterias que puede activar las integrinas β2 de los neutrófilos24. Cuando fMLP se une a Fpr1 en los neutrófilos, se activan cascadas de señalización aguas abajo que involucran proteínas G, fosfolipasa Cβ y fosfoinositida 3-quinasa γ. Estos eventos de señalización finalmente resultan en la activación de la integrina a través de la vía de señalización de adentro hacia afuera18,25. Además de los antagonistas de moléculas pequeñas que se unen directamente a las integrinas β2 y evitan los cambios conformacionales de la activación de las integrinas26, con este método también se detectarían compuestos que pueden inhibir los componentes de la vía de señalización de activación de la integrina β2 de adentro hacia afuera. Los citómetros de flujo automatizados permiten un cribado de alto rendimiento. La identificación de nuevos antagonistas no solo puede profundizar nuestra comprensión de la fisiología de las integrinas, sino que también puede proporcionar información traslacional sobre la terapia antiinflamatoria basada en integrinas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Este protocolo tiene como objetivo establecer un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de integrinas β2, utilizando anticuerpos que informan de cambios conformacionales y citometría de flujo de alto rendimiento. El método también puede servir como guía para otros métodos de cribado de alto rendimiento basados en anticuerpos. Las integrinas β2 son moléculas de adhesión específicas de los leucocitos que son cruciales en las respuestas inmunitarias. Los neutrófilos dependen de la activación de la integrina para salir del torrente sanguíneo, no solo para combatir infecciones, sino también para estar involucrados en múltiples enfermedades inflamatorias. El control de la activación de la integrina β2 presenta un enfoque viable para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias asociadas a los neutrófilos. En este protocolo, se utiliza un anticuerpo monoclonal, mAb24, que se une específicamente a la pieza principal de alta afinidad de las integrinas β2, para cuantificar la activación de las integrinas β2 en neutrófilos humanos primarios aislados. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) se utiliza como estímulo para activar las integrinas β2 de los neutrófilos. En este estudio se utilizó un citómetro de flujo de alto rendimiento capaz de procesar automáticamente muestras de placas de 384 pocillos. Los efectos de 320 sustancias químicas sobre la inhibición de la integrina β2 se evalúan en 3 h. A través de este enfoque, se pueden identificar moléculas que se dirigen directamente a las integrinas β2 o moléculas diana en la vía de señalización de activación de la integración iniciada por el receptor acoplado a la proteína G de adentro hacia afuera.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

Autor destacado: Desarrollo de un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de la integrina β2 

Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

Our research is focused on neutrophil integrin, and in this study we aim to establish a method to find small molecular antagonists of Beta-2 integrin activation. We believe with this method we can find new antagonists that may deepen our understanding in integrin physiology, and also provide translational insight into integrin-based anti-inflammatory therapy. In the future, we will focus on discovering new anti-inflammatory drugs and dissecting their mechanisms of action.

Los datos de un cribado representativo de placas de 384 pocillos (Figura 4) revelaron que los controles negativos tenían un IMF de mAb24-APC de 3236 ± 110, mientras que los controles positivos tenían un MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. El factor Z' para esta placa es de aproximadamente 0,33, que está dentro de un rango aceptablede 31. Sin embargo, Z' requiere una validación adicional en ensayos secundarios.
Para normalizar los datos, t...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of β2 Integrin Activation at JoVE.com

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Nuestra investigación se centra en la integrina de neutrófilos, y en este estudio pretendemos establecer un método para encontrar pequeños antagonistas moleculares de la activación de la integrina Beta-2. Creemos que con este método podemos encontrar nuevos antagonistas que puedan profundizar nuestra comprensión de la fisiología de las integrinas, y también proporcionar información traslacional sobre la terapia antiinflamatoria basada en integrinas. En el futuro, nos centraremos en descubrir nuevos fármacos antiinflamatorios y diseccionar sus mecanismos de acción.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K vistas.  UConn Health. Nuestra investigación se centra en la integrina de neutrófilos, y en este estudio pretendemos establecer un método para encontrar pequeños antagonistas moleculares de la activación de la integrina Beta-2. Creemos que con este método podemos encontrar nuevos antagonistas que puedan profundizar nuestra comprensión de la fisiología de las integrinas, y también proporcionar información traslacional sobre la terapia antiinflamatoria basada en integrinas. En el futuro, nos centraremos en ...

Video: Autor destacado: Desarrollo de un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de la integrina β2 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.