Para comenzar, cubra una placa de micropocillos con 150 microlitros de solución de fijación celular al 0,01 % al 0,1 % antes de incubar. Una vez que el plato se haya secado al aire, agregue 80 microlitros de solución de nanopartículas de oro gota a gota sobre la superficie seca. Al día siguiente, retire cualquier medio de cultivo agregado del micropocillo.
A continuación, añada dos mililitros de las células transfectadas sobre las nanopartículas de oro inmovilizadas en la superficie del vidrio. Incubar la placa antes del inicio de la experimentación. Utilice un microscopio confocal con un láser de órgano ajustado a 488 nanómetros para ver la fluorescencia GFP de la proteína anexina.
Ajuste el láser de helio y neón a 633 nanómetros para observar el reflejo de las nanopartículas de oro. Elija células individuales en lugar de grupos celulares para evitar la superposición de las membranas plasmáticas. Asegúrese de que las nanopartículas de oro inmovilizadas estén presentes como partículas individuales y adecuadamente espaciadas para evitar un aumento del gradiente térmico.
Utilice la pinza óptica para irradiar la nanopartícula de oro durante un segundo para alterar la membrana plasmática. Para generar vesículas unilamelares gigantes o GUV, aplique 90 microlitros de gel de PVA al 5% calentado en un portaobjetos de vidrio. Extienda el gel uniformemente sobre el portaobjetos.
A continuación, deje que el portaobjetos se seque en un armario calefactor a 50 grados centígrados durante 50 minutos. A continuación, utilice una jeringa de vidrio para aplicar 30 microlitros de mezcla de lípidos. Con el borde de la aguja, extienda la mezcla en una película delgada.
Aplique un flujo suave de gas nitrógeno para evaporar el cloroformo de la mezcla de lípidos. A continuación, seque los portaobjetos al vacío durante 1,5 a 2 horas. En un tubo separado de dos mililitros, agregue 400 microlitros de tampón de crecimiento.
A continuación, agregue la proteína recombinante de interés a una concentración final de 500 nano molares. Pipetear 400 microlitros de la proteína diluida en la cámara ensamblada internamente y envolver la cámara en PERIFIL. Después de una hora de incubación, transfiera 400 microlitros del contenido de la cámara a un tubo de dos mililitros.
Agregue un mililitro de tampón de observación en la solución recolectada para eliminar cualquier proteína no encapsulada. A continuación, centrifugar la solución a 600 G durante 10 minutos a 13 grados centígrados. A continuación, reemplace un mililitro del sobrenadante con tampón de observación y pipetee suavemente para dispersar los GUV.
Refrigerar hasta el inicio de la experimentación. Para perforar el GUV, primero cubra la superficie de un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros con beta caseína. A continuación, agregue 5 microlitros de nano conchas de oro de 150 nanómetros a la mezcla GUV que contiene cloruro de calcio.
Transfiera la mezcla a la cámara y móntela en la platina del microscopio. Utilice las pinzas ópticas para atrapar una nano carcasa de oro individual en la superficie del GUV. Cuando la nanocapa atrapada está en estrecho contacto con la membrana GUV, aumente la potencia del láser para perforar el sitio objetivo.
La irradiación de nanopartículas dio lugar a una lesión en la membrana y provocó un rápido reclutamiento de anexinas en el lugar de la lesión, tras la entrada de calcio para formar una estructura en forma de anillo. En los experimentos GUV, la punción de la membrana se volvió a sellar rápidamente en ausencia de anexinas. Las características biofísicas únicas de la proteína anexina A 4 condujeron a la ruptura del GUV debido a su capacidad para enrollar membranas.
La presencia de anexina en los GUV provocó una rápida acumulación en el sitio de la lesión, después de la punción de la membrana. El análisis de los anillos de anexina A 5 en los experimentos celulares mostró que permanecían constantes en el tiempo y el espacio. La alteración de la membrana plasmática mediante termoplasmónica provocó niveles elevados de iones de calcio.
Las células alcanzaron una intensidad máxima de calcio a los 6,6 segundos, un punto de tiempo que se presume que corresponde al momento del cierre de la herida.
