Para comenzar, agregue 500 microlitros de gel de cultivo tibio a un pocillo en una placa de 24 pocillos. Transfiera rápidamente los incisivos enteros disecados aislados del ratón al pocillo. Agite la placa unas cuantas veces para enjuagar los incisivos.
Agregue 400 microlitros de gel de cultivo tibio a una placa de cultivo y transfiera los incisivos enjuagados a la placa. Oriente el incisivo para colocar la región del asa cervical en el centro de la placa y ajuste la inclinación del incisivo apical para el plano de imagen deseado. Una vez que el gel esté listo, con un par de pinzas finas, retire cualquier gel en la parte superior de la región de interés.
Agregue aproximadamente 150 microlitros de medios de cultivo tibios contra el borde de la placa para cubrir la muestra. Coloque el cultivo de explantes a 37 grados centígrados para permitir que el tejido se asiente. Después de una hora, encienda el microscopio y el láser de dos fotones.
Fije la placa de cultivo al adaptador de platina y coloque el anillo adaptador de profusión en la parte superior. Conecte el adaptador de etapa a un controlador de temperatura para mantener el cultivo a 37 grados centígrados. Conecte la entrada y la salida del anillo adaptador a una bomba de microprofusión.
Ajuste la velocidad de profusión a 20 e inicie la profusión del medio sobre la muestra. Coloque un ACBR en la parte superior del anillo adaptador y eleve la platina para que el objetivo encaje a través del ACBR para hacer contacto con el medio de cultivo. Gire la longitud de onda del láser a 920 nanómetros para visualizar GFP.
Después de localizar la muestra a través de un ocular, visualícela con un software de microscopio, luego configure un tamaño de paso en Z de cuatro micrómetros y un intervalo de tiempo de cinco minutos durante 14 horas. Inicie la creación de imágenes de lapso de tiempo y guarde los archivos posteriores para el análisis de datos posterior. En microscopía time-lapse del K14-Cre; R26-rtTA; tetO-H2B-GFP asa cervical, las señales H2B-GFP se observaron predominantemente en la región transamplificadora del asa cervical, lo que indica divisiones celulares activas.
Además, se observó la condensación y alineación de los cromosomas en la placa metafásica en las células mitóticas, seguida de su segregación durante la anafase y en dos células hijas. La mayoría de las divisiones celulares fueron perpendiculares o en un ángulo oblicuo con respecto a la membrana basal, con menos divisiones horizontales paralelas a la membrana basal. Los eventos de división celular también fueron evidentes en K14-Cre; Asas cervicales R26-mT/mG donde todas las membranas de las células epiteliales estaban marcadas en verde.
Las células mitóticas se identificaron por su redondeo celular y posterior citocinesis. En K14-CRE; También se observaron asas cervicales R26-mT/mG, divisiones celulares tanto horizontales como verticales.
