Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Óptica/Espectroscopía Avanzada de la UCLA y al Centro de Excelencia de Leica Microsystems en el Instituto de Nanosistemas de California (RRID:SCR_022789) por proporcionar microscopía de dos fotones. AS fue apoyado por ISF 604-21 de la Fundación de Ciencias de Israel. JH contó con el apoyo de R03DE030205 y R01DE030471 de los NIH/NIDCR. AS y JH también recibieron el apoyo de 2021007 de subvenciones de la Fundación Binacional de Ciencias (BSF) de los Estados Unidos e Israel.

Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones de animales libres de patógenos en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) o la Universidad Hebrea de Jerusalén (HUJI). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las normas y protocolos aprobados por el respectivo Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). En la Figura 2A se muestra un flujo de trabajo general de los pasos experimentales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los instrumentos, reactivos y materiales utilizados en este protocolo.
1. Preparación de soluciones y geles
<ol><li>Medio de disección: Preparar DMEM/F12 fresco con glucosa al 0,5% y mantenerlo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 2.4. NOTA: Utilizamos DMEM/F12 sin rojo de fenol para reducir la autofluorescencia durante la obtención de imágenes en vivo.</li>
	<li>1x Medio de cultivo: Prepare un medio fresco con 50% DMEM/F12, 50% de suero de rata, 1x sustituto de glutamina, 1x aminoácidos no esenciales MEM, 1% de glucosa, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y 0,5% de penicilina-estreptomicina. Manténgalo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.5. Este medio se utiliza para el cultivo de explantes de incisivos durante la obtención de imágenes en vivo. NOTA: El suero de rata debe ser de alta calidad y estar especialmente preparado para el cultivo de tejidos enteros por parte de investigadores o de una fuente comercial. En particular, la sangre debe centrifugarse (durante 5 minutos a 1.200 × g a temperatura ambiente) antes de que comience a formarse la coagulación. Después de la centrifugación, el coágulo de fibrina resultante debe exprimirse y desecharse33.</li>
	<li>Gel de cultivo: El propósito del gel es inmovilizar las muestras durante la obtención de imágenes y se prepara fresco.<ol><li>Hacer gel al 2% en DMEM/F12 disolviendo 200 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 mL de DMEM/F12 usando un microondas. Mantener el gel al 2% a 37 °C.</li>
		<li>Prepare 2 medios de cultivo (sin DMEM/F12) mezclando suero de rata al 50 %, 1 sustituto de glutamina, 1 aminoácido no esencial MEM, glucosa al 1 %, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y penicilina-estreptomicina al 0,5 %. Calentar el medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12) a 37 °C.</li>
		<li>Haga gel de cultivo al 1% mezclando volúmenes iguales de gel al 2% y medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12). Mantenga el gel de cultivo al 1% a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.1. NOTA: Asegúrese de que todas las soluciones estén tibias antes de mezclarlas para evitar que se gelifiquen. Encontramos que el gel al 1% es adecuado para cultivar el incisivo de ratón adulto. El porcentaje de gel debe determinarse empíricamente si se van a cultivar otros tejidos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extracción de las mandíbulas de los ratones adultos
<ol><li>Sacrificar ratones a la edad deseada utilizando procedimientos estándar aprobados por la IACUC. NOTA: Aquí utilizamos asfixia por CO2 seguida de luxación cervical. Las regulaciones para la eutanasia animal pueden variar en diferentes regiones. Los investigadores deben obtener la aprobación institucional necesaria antes de realizar experimentos y garantizar el cumplimiento de las regulaciones locales de cuidado de animales.</li>
	<li>Desinfecte el ratón con etanol al 70%.</li>
	<li>Decapita al ratón y extrae las mandíbulas izquierda y derecha.<ol><li>Coloque el mouse sobre su vientre, luego use una hoja de afeitar industrial de un solo filo # 9 para cortar en la región del cuello y separar la cabeza del mouse del resto del cuerpo. NOTA: Si también se van a recolectar tejidos de la faringe o de la región del cuello, no se debe realizar la decapitación, y se puede proceder directamente al paso 2.3.2.</li>
		<li>Dale la vuelta al ratón para que su lado ventral quede hacia arriba y las mandíbulas sean fácilmente accesibles.</li>
		<li>Asegure la cabeza del animal sosteniéndola suavemente entre el pulgar y el índice.</li>
		<li>Usa la hoja de afeitar para hacer una incisión sagital media que corte sobre la piel de la mandíbula inferior desde el labio inferior hacia el escote. NOTA: También se puede usar una cuchilla quirúrgica # 15 para realizar la incisión y las disecciones posteriores (pasos 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>A medida que se realiza la incisión, extienda la piel cortada con el pulgar y el índice para exponer los músculos y la mandíbula debajo.</li>
		<li>Use la hoja de afeitar para cortar los músculos maseteros en el lado bucal de la mandíbula inferior, de modo que el exterior de los hemimandibles izquierdo y derecho ahora esté libre de inserciones musculares.</li>
		<li>Separe los músculos milohioideos a lo largo del lado interno de la mandíbula para eliminar las inserciones musculares allí.</li>
		<li>Haga otra incisión en la sínfisis mandibular que conecta los dos hemimandibles. Una vez cortada, la mandíbula se separará en las mitades izquierda y derecha.</li>
		<li>Coloque la hoja de afeitar entre el cóndilo mandibular y la articulación mandibular temporal y diseccione cuidadosamente el hemimandible del resto de la cabeza. NOTA: Nos resultó útil tirar suavemente del incisivo al mismo tiempo mientras se corta. Se debe tener cuidado para evitar romper la mandíbula y dañar los tejidos blandos del interior.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera inmediatamente las mandíbulas disecadas a una placa de Petri con el medio de disección precalentado (paso 1.1) y retire los tejidos musculares restantes con una cuchilla quirúrgica # 15. NOTA: Mantener las muestras en medios fríos ralentiza las actividades celulares, lo que resulta en recuperaciones retrasadas o incluso fallidas de ciertas actividades celulares, como la proliferación o el movimiento celular, durante la obtención de imágenes en vivo.</li>
</ol>3. Aislamiento de todos los incisivos del ratón
NOTA: El aislamiento adicional del incisivo se realiza bajo un microscopio de disección de campo claro.
<ol><li>Identificar visualmente la región ovalada de la mandíbula que cubre la cavidad del incisivo y alberga la porción apical del incisivo.</li>
	<li>Coloque la mandíbula de modo que la superficie interna (lingual) quede hacia arriba.</li>
	<li>Mientras sostiene la mandíbula en su lugar con un par de pinzas dentadas, genere una ventana en la región ovalada afeitando el hueso de la membrana suprayacente con una cuchilla quirúrgica # 15, en una dirección que sea desde el cóndilo hacia los molares. Esto expone el tejido blando del incisivo apical en la superficie interna.</li>
	<li>Dé la vuelta a la mandíbula de modo que la superficie externa (bucal) quede hacia arriba.</li>
	<li>Genere una ventana en la región ovalada de la mandíbula externa como se describe en el paso 3.3 y utilice la punta del bisturí para recoger los fragmentos óseos restantes en el borde. Asegúrese de que el extremo apical del diente sea visible desde ambos lados. NOTA: Evite la presión excesiva mientras afeita los huesos para evitar daños en los tejidos blandos subyacentes.</li>
	<li>Cortar sistemáticamente los huesos que rodean el incisivo para aislar todo el diente.<ol><li>Haga un corte limpio en un plano que esté inmediatamente adyacente al incisivo apical para eliminar primero la apófisis condilar. NOTA: Tenga cuidado de no cortar el incisivo.</li>
		<li>Hacer un segundo corte justo posterior al 3er molar, pero dorsal al incisivo sin dañar el diente. Esto elimina el hueso que incluye la apófisis coronoides.</li>
		<li>Cortar en serie desde la punta de la apófisis angular hacia el incisivo para eliminar gradualmente la mandíbula ventral de manera escalonada. NOTA: El epitelio dental y los tejidos periodontales asociados a menudo se adhieren al hueso y se arrancan fácilmente si se corta una gran parte del hueso ventral de una sola vez. Para separar el hueso del tejido blando del incisivo, se puede insertar el bisturí (o un par de pinzas afiladas no dentadas) entre los dos tejidos en el extremo apical del incisivo y deslizar delicadamente el instrumento hacia adelante.</li>
		<li>Corta el hueso alveolar con los molares y cualquier hueso restante que aún esté unido al incisivo.</li>
		<li>Ahora se aísla todo el incisivo. Transfiera el incisivo completamente diseccionado a una placa con medios de disección limpios y tibios (paso 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Repita los pasos 3.2-3.6 para aislar los incisivos adicionales según sea necesario. NOTA: Los incisivos maxilares/superiores del ratón también mantienen células madre adultas y pueden utilizarse para estudiar la regeneración dental34. Los investigadores dentales suelen centrarse en los incisivos inferiores porque son más accesibles y se pueden diseccionar más fácilmente que los incisivos superiores. Las diferencias entre las células progenitoras de los incisivos mandibulares y maxilares aún no se han determinado.</li>
</ol>4. Extirpación de tejidos periodontales para exponer el asa cervical epitelial incisivo
<ol><li>Con todo el incisivo acostado sobre su lado lingual y mientras sostiene el diente en su lugar con un par de pinzas dentadas, use un par de pinzas finas # 5 para comenzar a meter los tejidos periodontales que cubren el incisivo apical y la región del asa cervical.</li>
	<li>Retire con cuidado el tejido periodontal de la yema apical, de modo que el lado lateral del asa cervical (u otras regiones de interés) se haga visible debajo del endoscopio. NOTA: Se debe tener cuidado para evitar dañar el epitelio dental o desprenderlo del mesénquima. Si el incisivo tiene señales de fluorescencia en la región de interés y se dispone de un microscopio de disección fluorescente, se pueden utilizar señales de fluorescencia para ayudar a distinguir entre los tipos de tejido y ayudar a las disecciones. Es importante llevar a cabo eficientemente las secciones 2-4 para que las muestras puedan transferirse rápidamente a los medios de cultivo y mantenerse adecuadamente mediante el cultivo de explantes (véase más adelante).</li>
</ol>5. Inclusión de tejidos para el cultivo de explantes
<ol><li>Agregue 500 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a un pocillo en una placa de 24 pocillos y transfiera rápidamente los incisivos enteros disecados al pocillo. Agite la placa unas cuantas veces para enjuagar los incisivos.</li>
	<li>Añadir 400 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a una placa de cultivo y transferir los incisivos enjuagados a la placa. NOTA: Utilizamos una placa de cultivo disponible comercialmente que es compatible con la configuración de perfusión. Consulte el paso 6.4 para ver las opciones alternativas.</li>
	<li>Oriente el incisivo para colocar la región del asa cervical (u otras regiones de interés) en el centro de la placa (Figura 2A, B) y ajuste la inclinación del incisivo apical para el plano de imagen deseado. NOTA: La orientación de los tejidos debe realizarse rápidamente antes de la gelificación completa.</li>
	<li>Después de fijar el gel, use un par de pinzas finas para quitar cualquier gel en la parte superior de la región de interés para que no quede cubierto por el gel.</li>
	<li>Agregue un volumen suficiente de medio de cultivo tibio pipeteándolo lentamente contra el borde de la placa para cubrir solo la muestra (~ 150 μL).</li>
	<li>Trasladar el cultivo de explantes a una incubadora de cultivos celulares a 37 °C para permitir la sedimentación del tejido y el ajuste a las condiciones de cultivo durante 1 h.</li>
</ol>6. Microscopía timelapse de explantes de incisivos
NOTA: En este experimento, utilizamos un microscopio vertical equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x que tiene una apertura numérica de 1. En general, una lente de inmersión en agua con una apertura numérica alta es la más adecuada para la obtención de imágenes de tejidos profundos.
<ol><li>Encienda el microscopio y el láser de dos fotones.</li>
	<li>Fije la placa de cultivo al adaptador de platina y monte el anillo adaptador de perfusión en la parte superior (Figura 2C).</li>
	<li>Conecte el adaptador de platina a un controlador de temperatura configurado para mantener el cultivo a 37 °C.</li>
	<li>Conecte la entrada y la salida del anillo adaptador a una bomba de microperfusión y comience la perfusión del medio de cultivo, con la velocidad de perfusión establecida en 20 en la bomba. Esto genera un flujo lento (~5 mL/h) del medio de cultivo sobre la parte superior de las muestras (Figura 2C). NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el sistema para mantener el tejido en un entorno controlado de manera estable. También se pueden utilizar otros sistemas. También se puede utilizar una combinación de una placa calefactora a 37 °C y una placa de cultivo de perfusión casera (figura complementaria S1) con una entrada y una salida conectadas a bombas de jeringa.</li>
	<li>Coloque un anillo de barrera de control atmosférico (ACBR) en la parte superior del anillo adaptador y baje el objetivo a través del ACBR para hacer contacto con el medio de cultivo (Figura 2D).</li>
	<li>Ajuste la longitud de onda del láser a 920 nm para visualizar las señales de GFP y fluorescencia roja (por ejemplo, tdTomato).</li>
	<li>Localice las muestras a través de oculares y luego en el software del microscopio.</li>
	<li>Configure pilas Z, imágenes de múltiples posiciones e intervalos de tiempo con el software. Para seguir este protocolo, utilice un tamaño de paso z de 4 μm y un intervalo de tiempo de 5 min durante 14 h. NOTA: Encontramos que un intervalo de tiempo de más de 5 minutos a menudo es insuficiente para capturar movimientos y divisiones celulares suaves.</li>
	<li>Inicie las imágenes de lapso de tiempo. NOTA: La posición de la muestra puede cambiar durante la primera hora y es posible que se requieran ajustes adicionales.</li>
	<li>Guarde archivos para el procesamiento y análisis de datos posteriores.</li>
</ol>

Seguimiento en vivo de células dentales mediante microscopía de dos fotones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La imagen de tejido vivo es una técnica importante que nos permite estudiar los procesos dinámicos y el comportamiento de las células cuando se mantienen en su entorno de nicho41. Idealmente, las imágenes en vivo se realizan in vivo con una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, la obtención de imágenes in vivo de órganos de mamíferos puede ser un reto debido a la inaccesibilidad de los tejidos, la opacidad óptica y la dificultad para inmovilizar al animal o al ...

En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental 1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente 1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la matriz del esmalte, las células madre mesenquimales dentales dan lugar a odontoblastos, cementoblastos y fibroblastos, que forman la dentina, el cemento y el ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Este suministro constante de nuevas células mantiene la homeostasis tisular y permite la reposición de células viejas que se pierden debido al desgaste masticatorio o a las lesiones 7,8. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre dentales es fundamental para comprender la regeneración dental, un área de creciente interés.
Anatómicamente, una gran parte del incisivo del ratón adulto está encerrada en la mandíbula. Mientras el borde incisal del diente está expuesto, el extremo apical del incisivo encaja dentro de un alvéolo y está firmemente unido al hueso circundante a través de los ligamentos periodontales y los tejidos conectivos (Figura 1A, B). El extremo apical del incisivo es también la región de crecimiento del diente y mantiene las células madre y progenitoras dentales tanto en la capa epitelial como en la pulpa mesenquimal 9,10,11,12,13. Específicamente, las células madre epiteliales dentales se mantienen en el extremo bulboso del epitelio, conocido como yema apical, también conocida como asa cervical labial (Figura 1C). Al igual que el epitelio intestinal y la epidermis, la renovación epitelial en el incisivo se apoya principalmente en el ciclo activo de las células madre y sus descendientes intermedios altamente proliferativos, llamados células amplificadoras de tránsito 14,15,16,17, ambas residiendo en la parte interna del asa cervical. Sin embargo, aún no se ha determinado si el epitelio incisivo contiene y utiliza células madre quiescentes durante la regeneración. Por el contrario, se han identificado células madre mesenquimales dentales activas y quiescentes en la pulpa apical, y las células madre quiescentes funcionan como una población de reserva que se activa durante la reparación de la lesión13,18.
Muchos de los descubrimientos sobre la biología de la renovación y regeneración de los incisivos del ratón han sido el resultado de investigaciones histológicas, en las que las muestras se obtienen en distintas coyunturas temporales, se fijan, se procesan y luego se seccionan en rodajas de una micra de espesor a lo largo de un plano particular. A través de un análisis detallado de secciones histológicas de diferentes modelos de ratón que permiten el rastreo de linajes o perturbaciones genéticas, los científicos han identificado los linajes celulares de diferentes poblaciones de progenitores, así como las vías genéticas y de señalización que controlan la homeostasis de los incisivos y la reparación de lesiones 19,20,21. Sin embargo, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) de células no vitales en secciones no pueden capturar el espectro completo de comportamientos celulares y organizaciones espaciales en el tejido vivo, como los cambios en la forma de las células, los movimientos y la cinética celular. Detectar y medir estos cambios celulares rápidos, que ocurren en una escala de tiempo que no se puede resolver a través del corte de tejidos, requiere una estrategia diferente. Además, la adquisición de dicha información también es fundamental para comprender cómo las células dentales interactúan entre sí, reaccionan a diferentes estímulos de señalización y se autoorganizan para mantener las estructuras y funciones de los tejidos.
El advenimiento de la obtención de imágenes de tejidos profundos en cuatro dimensiones (4D) mediante microscopía de dos fotones22, una tecnología que integra tres dimensiones espaciales con resolución temporal, supera las limitaciones inherentes al análisis histológico al permitir el examen espaciotemporal de explantes de tejidos cultivados, organoides o incluso tejidos in situ 23,24,25,26 . Por ejemplo, las imágenes en vivo en 4D del epitelio dental en desarrollo han revelado los patrones espacio-temporales de las divisiones celulares y las migraciones que coordinan el crecimiento del tejido, la formación del centro de señalización y la morfogénesis epitelial dental 27,28,29,30,31,32. En el incisivo de ratón adulto, las imágenes 4D se han adaptado recientemente para estudiar los comportamientos celulares durante la reparación de lesiones epiteliales dentales. Las imágenes en vivo revelaron que las células del estrato intermedio en la capa suprabasal pueden convertirse directamente en ameloblastos en la capa basal para regenerar el epitelio dañado, desafiando el paradigma tradicional de reparación de lesiones epiteliales15.
Aquí, describimos la disección, el cultivo y la obtención de imágenes del incisivo de ratón adulto, centrándonos en las células epiteliales del asa cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva la vitalidad de las células dentales durante más de 12 h y permite el seguimiento en vivo de las células marcadas con fluorescencia a una resolución de una sola célula. Este enfoque permite investigar el movimiento y la migración celular, así como los cambios dinámicos en la forma celular y la orientación de la división en condiciones normales de cultivo, o en respuestas a perturbaciones genéticas, físicas y químicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

El incisivo de ratón en continuo crecimiento está emergiendo como un sistema modelo altamente manejable para investigar la regulación de las células madre epiteliales y mesenquimales adultas y la regeneración dental. Estas poblaciones progenitoras se dividen, se mueven y se diferencian activamente para mantener la homeostasis tisular y regenerar las células perdidas de manera receptiva. Sin embargo, los análisis tradicionales que utilizan secciones fijas de tejido no pudieron capturar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares, lo que limitó nuestra capacidad para estudiar sus regulaciones. En este trabajo se describe un protocolo para mantener incisivos enteros de ratón en un sistema de cultivo de explantes y células epiteliales dentales de seguimiento vivo mediante microscopía de lapso de tiempo multifotónica. Esta técnica se suma a nuestra caja de herramientas existente para la investigación dental y permite a los investigadores adquirir información espacio-temporal sobre el comportamiento y las organizaciones celulares en un tejido vivo. Anticipamos que esta metodología ayudará a los investigadores a explorar más a fondo los mecanismos que controlan los procesos celulares dinámicos que tienen lugar tanto durante la renovación como durante la regeneración dental.

Over the past two decades, the mouse incisor has emerged as an invaluable platform for investigating the principles of adult stem cell regulation and tooth regeneration1,2. The mouse incisor grows continuously and renews itself throughout the animal&#39;s life. It does so by maintaining both epithelial and mesenchymal stem cells, which can self-renew and differentiate into different cell types of the tooth1,2. While dental epithelial stem cells give rise to ameloblasts, which secrete the enamel matrix, dental mesenchymal stem cells give rise to odontoblasts, cementoblasts, and fibroblasts, which form dentin, cementum, and periodontal ligament, respectively3,4,5,6. This constant supply of new cells maintains tissue homeostasis and allows the replacement of old cells that are lost due to masticatory wear or injuries7,8. Elucidating the cellular and molecular mechanisms that regulate the maintenance and differentiation of dental stem cells is therefore central to understanding dental regeneration, an area of growing interest.
Anatomically, a large portion of the adult mouse incisor is encased in the jawbone. While the incisal edge of the tooth is exposed, the apical end of the incisor fits within a socket and is firmly attached to the surrounding bone through periodontal ligaments and connective tissues (Figure 1A,B). The incisor&#39;s apical end is also the growth region of the tooth and maintains dental stem and progenitor cells in both the epithelial layer and the mesenchymal pulp9,10,11,12,13. Specifically, dental epithelial stem cells are maintained at the bulbous end of the epithelium, known as the apical bud, also referred to as the labial cervical loop (Figure 1C). Similar to the intestinal epithelium and the epidermis, epithelial renewal in the incisor is primarily supported by actively cycling stem cells and their highly proliferative intermediate descendants, called transit-amplifying cells14,15,16,17, both residing in the inner part of the cervical loop. However, whether the incisor epithelium contains and utilizes quiescent stem cells during regeneration remains to be determined. In contrast, both active and quiescent dental mesenchymal stem cells have been identified in the apical pulp, and the quiescent stem cells function as a reserve population that becomes activated during injury repair13,18.
Many of the discoveries on the biology of the mouse incisor renewal and regeneration have resulted from histological investigations, in which samples are obtained at distinct temporal junctures, fixed, processed, and then sectioned into micron-thin slices along a particular plane. Through detailed analysis of histological sections from different mouse models that enable lineage tracing or genetic perturbations, scientists have identified the cell lineages of different progenitor populations, as well as the genetic and signaling pathways that control incisor homeostasis and injury repair19,20,21. However, the static two-dimensional (2D) images of non-vital cells in sections cannot capture the full spectrum of cellular behaviors and spatial organizations in living tissue, such as cell shape changes, movements, and cellular kinetics. Detecting and measuring these rapid cellular changes, which occur at a timescale that is unresolvable through tissue sectioning, require a different strategy. Moreover, acquiring such information is also critical for understanding how dental cells interact with each other, react to different signaling stimuli, and self-organize to maintain tissue structures and functions.
The advent of four-dimensional (4D) deep tissue imaging using two-photon microscopy22, a technology that integrates three spatial dimensions with temporal resolution, overcomes the inherent limitations of histological analysis by enabling spatiotemporal examination of cultured tissue explants, organoids, or even tissues in situ23,24,25,26. For instance, 4D live imaging of the developing tooth epithelium has unveiled the spatiotemporal patterns of cell divisions and migrations that coordinate tissue growth, signaling center formation, and dental epithelial morphogenesis27,28,29,30,31,32. In the adult mouse incisor, 4D imaging has been recently adapted to study cellular behaviors during dental epithelial injury repair. Live imaging revealed that stratum intermedium cells in the suprabasal layer can be directly converted into ameloblasts in the basal layer to regenerate the damaged epithelium, challenging the traditional paradigm of epithelial injury repair15.
Here, we describe the dissection, culturing, and imaging of the adult mouse incisor, focusing on epithelial cells in the labial cervical loop (Figure 1). This technique preserves dental cell vitality for more than 12 h and permits live tracking of fluorescently labeled cells at single-cell resolution. This approach allows investigation of cell motion and migration as well as dynamic changes in cell shape and division orientation under normal culture conditions, or in responses to genetic, physical, and chemical perturbations.

Autor destacado: Comprensión de los comportamientos celulares dinámicos en la renovación y reparación de tejidos dentales de ratones adultos 

Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

To maintain the correct cellular organization during organ renewal, tissue approaching the cells move and dividing specific orientations and patterns. It is therefore important to understand the rules and regulations of these dynamic cellular events. The mouse incisor is an emerging model for adult stem cell research, and many genetic tools are available in the system to study gene functions, and to label cells for lineage tracing.Most studies to date use adult dental samples collected and fixed its specific time points, and this prevents us from examining life cell behavior. In this protocol, we describe a method to track lifestyles in the adult mouse incisor, and this technique will enable future studies that aim to understand how dynamic cell behaviors contribute to the renewal and repairment of dental tissues.

La región apical del incisivo del ratón adulto está encerrada dentro de la mandíbula (Figura 1) y, por lo tanto, no es directamente accesible para visualizar y rastrear en vivo las células progenitoras que residen dentro de la región de crecimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para extraer todo el incisivo de la mandíbula y mantenerlo en un sistema de cultivo de explantes para microscopía timelapse de dos fotones (Figura 2). Aquí describ...

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La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Para mantener la correcta organización celular durante la renovación de órganos, el tejido que se acerca a las células se mueve y se divide en orientaciones y patrones específicos. Por lo tanto, es importante comprender las reglas y regulaciones de estos eventos celulares dinámicos. El incisivo de ratón es un modelo emergente para la investigación con células madre adultas, y hay muchas herramientas genéticas disponibles en el sistema para estudiar las funciones de los genes y para etiquetar las células para el rastreo del linaje.La mayoría de los estudios realizados hasta la fecha utilizan muestras dentales de adultos recogidas y fijan sus puntos temporales específicos, y esto nos impide examinar el comportamiento de las células vivas. En este protocolo, describimos un método para rastrear los estilos de vida en el incisivo de ratón adulto, y esta técnica permitirá futuros estudios que tengan como objetivo comprender cómo los comportamientos celulares dinámicos contribuyen a la renovación y reparación de los tejidos dentales.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

872 vistas.  University of California Los Angeles. Para mantener la correcta organización celular durante la renovación de órganos, el tejido que se acerca a las células se mueve y se divide en orientaciones y patrones específicos. Por lo tanto, es importante comprender las reglas y regulaciones de estos eventos celulares dinámicos. El incisivo de ratón es un modelo emergente para la investigación con células madre adultas, y hay muchas herramientas genéticas disponibles en el sistema para estudiar las funciones de los genes y para ...

Video: Autor destacado: Comprensión de los comportamientos celulares dinámicos en la renovación y reparación de tejidos dentales de ratones adultos 

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.

Investigación

Biología del Desarrollo

Dissection and Isolation of Mouse Mandibular Incisors and Associated Periodontal Tissues to Expose the Incisor Epithelial Cervical Loop

To begin, turn the euthanized mouse over so its ventral side faces up and the mandibles are easily accessible. Secure the mouse's head gently between the thumb and the index finger. Using a razor blade, starting from the lower lip toward the neckline, make a mid-sagittal incision on the lower jaw skin.During the incision, use the thumb and index finger to open the cut skin, exposing the underneath muscles and jawbone. Next, sever the masseter muscles on the buccal side of the lower jaw. Sever the mylohyoid muscles along the inner side of the mandible and remove muscle attachments.Make another incision at the mandibular synthesis, connecting the two hemi-mandibles, separating them into the left and right halves. Wedge the razor blade between the mandibular condyle and the temporal mandibular joint to carefully dissect out the hemi mandible from the rest of the head. Immediately transfer the dissected mandibles to a Petri dish containing pre-warmed dissection medium.Next, under a brightfield dissection microscope, use a number 15 surgical blade to remove muscle tissues. Identify the oval region of the mandible that covers the incisor socket and houses the apical portion of the incisor. Position the mandibles such that the inner or lingual surface is facing upward.While holding the mandible with a pair of serrated forceps, using a number 15 surgical blade, shave off the overlying membrane bone from the condyle towards the molars to generate a window at the oval. This exposes the soft tissue of the apical incisor on the inner surface. Next, turn the mandible so the outer or buccal surface faces upwards.As demonstrated for the inner mandible, generate a window at the oval region on the outer mandible. Using a pair of forceps, pick away the remaining bone fragments at the edge, ensuring that the apical end of the tooth is visible from both sides. To isolate the entire tooth, make a clean cut at a plane immediately adjacent to the apical incisor to remove the condylar process.Then make a second cut just posterior to the third molar, but dorsal to the incisor, without damaging the tooth, to remove the coronary process. Serially cut from the tip of the angular process towards the incisor to gradually remove the ventral mandible. Next, cut away the alveolar bone with molars and any remaining bones that are still attached to the incisor.Transfer the fully dissected incisor to a dish containing warm dissection media. Turn on the fluorescent microscope and use the fluorescent signal from tissues to guide the removal of periodontium. Position the inner incisor on its lingual side, and using serrated forceps hold the tooth in place.Then using a pair of number five fine forceps, start tugging on the periodontal tissues, covering the apical incisor, and the cervical loop region. Carefully peel off periodontal tissues from the apical bud, such that the lateral side of the cervical loop is visible.

Disección y aislamiento de incisivos mandibulares de ratón y tejidos periodontales asociados para exponer el asa cervical epitelial del incisivo

Periodontal Tissue Embedding and Timelapse Microscopy of Mouse Incisor Explant Cultures

To begin, add 500 microliters of warm culture gel to a well in a 24-well plate. Quickly transfer the dissected whole incisors isolated from the mouse to the well. Swirl the plate a few times to rinse the incisors.Add 400 microliters of warm culture gel to a culture dish and to transfer the rinsed incisors to the dish. Orient the incisor to position the cervical loop region at the center of the dish and adjust the tilt of the apical incisor for the desired imaging plane. Once the gel is set, using a pair of fine forceps, remove any gel on top of the region of interest.Add approximately 150 microliters of warm culture media against the edge of the dish to cover the sample. Place the explant culture at 37 degrees Celsius to allow the tissue to settle. After one hour, turn on the microscope and the two-photon laser.Secure the culture dish to the stage adapter and place the profusion adapter ring on top. Connect the stage adapter to a temperature controller to maintain the culture at 37 degrees Celsius. Connect the inlet and the outlet of the adapter ring to a microprofusion pump.Set the profusion speed to 20 and initiate the profusion of the medium over the sample. Place an ACBR on top of the adapter ring and raise the stage so the objective fits through the ACBR to make contact with the culture medium. Turn the laser wavelength to 920 nanometers to visualize GFP.After locating the sample through an eyepiece, visualize it with a microscope software, then set up Z-step size of four micrometers and a time interval of five minutes for 14 hours. Initiate the time-lapse imaging and save the subsequent files for downstream data analysis. In time-lapse microscopy of the K14-Cre;R26-rtTA;tetO-H2B-GFP cervical loop, the H2B-GFP signals were predominantly observed in the trans-amplifying region of the cervical loop, indicating active cell divisions.Further, the condensation and alignment of chromosomes at the metaphase plate in mitotic cells followed by their segregation during anaphase and into two daughter cells was observed. Most cell divisions were perpendicular or at an oblique angle relative to the basement membrane with fewer horizontal divisions parallel to the basement membrane. Cell division events were also apparent in K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops where all epithelial cell membranes were labeled green.Mitotic cells were identified by their cell rounding and subsequent cytokinesis. In K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops, both horizontal and vertical cell divisions were also observed.