Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

Para comenzar la disociación tisular, recoja uno o dos centímetros cúbicos de carcinoma hepatocelular o tejido HTC de pacientes no tratados. A continuación, coloque el tejido en la solución de conservación de tejidos y manténgalo a cuatro grados centígrados hasta su procesamiento. Ahora, precaliente las placas de cultivo celular de superficie de fijación ultra baja durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados.

Descongele el extracto de la membrana basal durante la noche a cuatro grados centígrados. Con unas tijeras quirúrgicas, corte el tejido tumoral en trozos pequeños en una placa de Petri dentro de una campana de flujo laminar. Transfiera estas piezas a un tubo cónico de 15 mililitros y agregue de cinco a 10 mililitros de medio basal.

Con una pipeta barotrópica, elimine la mayor cantidad de sangre posible. Deje que la mezcla se asiente durante uno o dos minutos antes de eliminar parte del sobrenadante, incluidas las células sanguíneas y los coágulos de grasa flotantes. A continuación, centrifuga la mezcla a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, extraiga con cuidado el sobrenadante y añada cinco mililitros de solución de digestión precalentada al tejido recortado. Coloque el tubo a 37 grados centígrados en un rotor para una digestión óptima. Después de 30 minutos de la digestión inicial, use un microscopio para buscar grupos de células pequeñas.

Para detener la digestión, agregue cinco mililitros de medio basal frío al tubo. A continuación, utilice un filtro de celda de 100 micrómetros para tamizar en un nuevo tubo de 50 mililitros. Llene el tubo con medio basal frío hasta alcanzar un volumen total de 50 mililitros.

A continuación, centrifuga las células a dos G durante 10 minutos a ocho grados centígrados. Una vez completado, retire con cuidado el líquido sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 50 mililitros de medio basal frío para obtener el gránulo celular para la siembra de organoides.